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自主跑轮运动通过促进海马神经发生改善甲醛所致小鼠的负性情绪

2021-10-08 127 上传者：管理员

摘要：目的探讨自主跑轮运动对甲醛疼痛模型小鼠负性情绪的影响。方法30只昆明雄鼠随机分成生理盐水对照组(NS)、甲醛组(F)、自主跑轮运动+甲醛组(R+F)。右后爪足底皮下注射0.4%甲醛建立疼痛模型,R+F组在模型建立之前置于小鼠跑轮运动装置3周。以实验小鼠舔足累计时间评价自发痛行为;采用旷场实验(OFT)和高架十字迷宫实验(EPM)检测小鼠焦虑样行为;采用被迫游泳实验(FST)检测小鼠抑郁样行为;采用免疫组织化学方法检测海马未成熟神经元标记物双皮层蛋白(DCX)的表达情况。结果自发痛评分结果显示,与NS组相比,F组小鼠出现典型的双相痛反应,与F组相比,R+F组小鼠的第Ⅱ相时段舔咬足累计时间明显缩短(P<0.01)。旷场实验结果显示,与NS组相比,F组小鼠在中央格探索时间显著减少(P<0.001),与F组相比,R+F组小鼠在中央格探索的时间增加(P<0.05)。高架十字迷宫实验结果显示,与NS组相比,F组小鼠进入开放臂的时间显著减少(P<0.001),与F组相比,R+F组小鼠进入开放臂的时间增加(P<0.05)。被迫游泳实验结果显示,与NS组相比,F组小鼠不动时间明显增加(P<0.01),与F组相比,R+F组小鼠不动时间缩短(P<0.05)。免疫组织化学结果显示,与NS组(250.90±16.22)相比,F组小鼠海马DCX阳性细胞面积(210.90±7.98)减少,与F组相比,R+F组小鼠海马DCX阳性细胞面积显著增多(284.00±9.84)。结论自主跑轮运动可能通过促进海马神经发生,从而改善甲醛所致小鼠的自发痛与焦虑、抑郁样行为。

关键词：
免疫组织化学
小鼠
抑郁样行为
焦虑样行为
甲醛
疼痛
神经发生
自主跑轮运动
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疼痛是临床上最常见的症状之一。据统计，世界上1/3的人口正经受疼痛的折磨[1]。疼痛伴随的负性情绪，如焦虑和抑郁，可以导致疾病的恶化，严重影响患者的生活质量[2]。然而，不同个体在疼痛阈值及疼痛相关的负性情绪上存在差异，产生差异的原因可能与个体不同经历相关。自主跑轮运动是一种广泛用于测量各种情况下啮齿动物身体活动情况的实验方法[5]。研究发现，自主跑轮运动可改善阿尔茨海默病模型小鼠焦虑和抑郁样行为，也能缓解小鼠母婴分离应激导致的小鼠抑郁样和焦虑样行为[7]。不少研究者认为，自主跑轮运动的作用机制可能与其促进海马神经发生密切相关。海马神经发生受损是疼痛患者抑郁症发生的原因之一[11]。本实验旨在研究早期自主跑轮运动对甲醛所致负性情绪的影响。

材料和方法

1．实验动物

3周龄昆明雄鼠，体重8～10g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号:SYXK(湘)2018-0001。实验前适应性饲养1周，所有小鼠饲养于南华大学实验动物中心。饲养条件:12h/12h昼夜节律，室温(22±2)°C，湿度55%±5%，自由摄食和饮水。实验由南华大学动物护理和使用委员会批准，并根据国家卫生指南研究所批准，用于实验室动物的护理和使用。

2．主要试剂与设备

甲醛(Sigma-Aldrich公司，批号:016M4187Ⅴ);羊血清(Boster公司，AR0009);羊抗双皮层蛋白(doublecortin,DCX)单克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，13925-1-AP);生物素化兔抗羊单克隆抗体(CWBIO公司，CW0107);过氧化物酶标记的ABC复合物(Vector公司，PK-4000);DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9019)。

3．自主跑轮运动

自主跑轮运动装置箱为一宽敞5面木箱(长×宽×高为120cm×100cm×60cm)，箱中放置10组跑轮装置，实验小鼠每天在自主跑轮运动箱中自由活动6h(AM9∶00～PM15∶00)，连续3周。

4．甲醛模型建立及疼痛评分

甲醛实验参照Hunskaar等[12]描述进行。实验小鼠均置于实验箱中预适应30min以减轻自发探索行为对实验结果的影响。小鼠随机分成生理盐水对照组(NS)、甲醛(formaldehyde)组(F)、自主跑轮(runner)运动+甲醛组(R+F)。F组和R+F组小鼠予以单次右后足皮下注射25μl0.1%甲醛构建甲醛模型，NS组小鼠则给予等体积生理盐水作为对照。摄像并记录实验小鼠舔咬足时间1h，以小鼠舔咬足累计时间作为自发痛评价指标(根据甲醛所致小鼠双相疼痛表现，疼痛第Ⅰ相时间段为0～10min，第Ⅱ相时间阶段为10～60min)。此外，为避免运动对行为的急性影响，R+F组小鼠于末次自主跑轮运动24h后建立甲醛疼痛模型。

5．旷场实验

旷场实验(openfieldtest,OFT)采用我们以前的研究方法[13]。OFT装置箱(长×宽×高，40cm×40cm×40cm)内等分为25个方格，中间9格为中央格，周边16格为周围格。实验时，将小鼠置于旷场中央格，摄像记录小鼠在旷场内的活动情况5min。更换实验小鼠前，以20%医用乙醇擦拭旷场，减轻小鼠分泌物的影响。以小鼠穿越中央格的时间作为焦虑样行为的评价指标;以小鼠穿越中央格与周围格的总次数评价其活动度。

6．高架十字迷宫实验

高架十字迷宫实验(elevatedplus-mazetest,EPM)根据之前建立的方案施行[14]。EPM装置由呈十字交叉的1对开放臂(长×宽，50cm×10cm)与1对闭合臂(长×宽×高，50cm×10cm×30cm)以及连接4臂的中央平台(10cm×10cm)组成，平台距地面60cm。实验时，将小鼠置于迷宫的中央平台处，使其头部朝向远离实验者的开放臂，并立即摄像记录小鼠活动5min。以小鼠进入开放臂的次数与时间作为其焦虑样行为的评价指标，以小鼠至少3足进入开放臂作为有效记录。

7．强迫游泳实验

强迫游泳实验(forcedswimmingtest,FST)根据我们以前研究方法施行[15]。FST装置为一开口圆柱形玻璃箱(高×直径，25cm×10cm)。实验时，以23～25℃水置入玻璃箱中，直至距箱底13cm处，将小鼠轻放于装置中，随即摄像记录小鼠活动6min。以后4min小鼠的不动时间作为其抑郁样行为的评价指标。小鼠漂浮并且仅进行使其头部保持在水的表面上方的轻微划动时计为有效不动时间。

8．免疫组织化学实验

采用1%戊巴比妥(4.5g/L)腹腔注射麻醉小鼠，分别用生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌注固定动物。快速剥离脑组织置于4%多聚甲醛中固定后在4℃冰箱过夜，再经15%和30%蔗糖溶液梯度脱水，冷冻切片机行连续冠状切片，厚30μm。取小鼠海马部位切片，每组3～4只，每只小鼠3张切片，将切片在室温下浸入3%H2O2中28min,PBS漂洗3次，每次10min;加入5%免血清室温封闭2h，加入羊抗DCX多克隆抗体(1∶1000)室温封闭2h后于4℃冰箱过夜;次日复温30min后漂洗，漂洗方式如前，生物素化兔抗山羊IgG二抗(1∶200)室温孵育2h;漂洗后加入提前2h配好的过氧化酶标记的ABC复合物(1∶200)，室温孵育2h后再次漂洗;最后行DAB溶液显色，贴片晾干，所有切片均在梯度乙醇和二甲苯中脱水，并使用中性树脂胶封片。所有图像均在相同条件下摄片获得，并在光学显微镜100μm标尺下计数每组小鼠海马样品中DCX阳性细胞的总数。

9．数据分析

使用GraphpadPrism5.0统计学软件(GraphpadSoftware公司)进行分析，实验数据采用均值±标准误表示。多组之间比较采用单因素方差分析，PostHocTest进行组间多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。ANOVA用于分析甲醛研究的所有数据。单因素方差分析用于分析甲醛和运动训练对焦虑样行为的影响。P<0.05代表有统计学意义。

结果

1．自主跑轮运动对甲醛模型小鼠疼痛的影响

单因素方差分析(One-wayANOVA)显示，自主跑轮运动可以减轻甲醛模型小鼠的疼痛行为[F(2,21)=21.28,P<0.001，图1A]。如图1B所示，与NS组第Ⅰ时相(6.50±3.84)s和第Ⅱ时相(16.67±8.46)s相比，F组小鼠第Ⅰ时相(62.67±7.44)s和第Ⅱ时相(166.36±19.19)s疼痛评分升高(P<0.05,P<0.001);与F组(166.36±19.19)s相比，R+F组(84.57±7.44)小鼠在第Ⅱ时相疼痛评分明显减少(P<0.001)，表明，自主跑轮运动可以减轻甲醛模型小鼠第Ⅱ时相疼痛行为。

2．自主跑轮运动对甲醛模型小鼠活动度的影响

One-wayANOVA显示，各组小鼠活动度无明显差异[F(2,45)=1.755,P>0.05，图2]。与NS组(133.80±7.93)相比，F组(146.40±5.39)小鼠在旷场中的穿越格子总数差异并无统计学意义(P>0.05);与F组(146.40±5.39)相比，R+F组小鼠(149.90±5.37)在旷场中的穿越格子总数差异也无统计学意义(P>0.05)。

3．自主跑轮运动对甲醛模型小鼠焦虑样行为的影响

3.1自主跑轮运动对甲醛模型小鼠旷场实验的影响:One-wayANOVA显示，自主跑轮运动可增加甲醛模型小鼠在旷场中央格的探索时间[F(2,44)=8.082,P<0.01，图3]。与NS组(24.93±2.20)s相比，F组(13.61±1.46)s小鼠在旷场中央格区域探索时间明显减少(P<0.001);与F组(13.61±1.46)s相比，R+F组(22.15±2.18)s小鼠在旷场中央格区域探索时间明显增加(P<0.05)，表明自主跑轮运动可以改善小鼠的焦虑样行为。

3.2自主跑轮运动对甲醛模型小鼠高架十字迷宫实验的影响:One-wayANOVA显示，自主跑轮运动可增加甲醛模型小鼠在开放臂的探索时间[F(2,36)=10.33,P<0.001，图4]。与NS组(36.50±1.93)s相比，F组(11.47±2.66)s小鼠在开放臂的探索时间明显减少(P<0.001);与F组(11.47±2.66)s相比，R+F组小鼠(25.43±4.35)s在开放臂的探索时间明显增加(P<0.05)，表明自主跑轮运动可以改善小鼠的焦虑样行为。

4．自主跑轮运动对甲醛模型小鼠抑郁样行为的影响

One-wayANOVA显示，自主跑轮运动可减少甲醛模型小鼠被迫游泳不动时间[F(2,36)=8.661,P<0.001，图5]。与NS组(134.60±10.34)s相比，F组(196.40±6.38)s小鼠的不动时间明显增加(P<0.01);与F组(196.40±6.38)s相比，R+F组小鼠(152.90±13.80)s的不动时间明显减少(P<0.05)，表明自主跑轮运动可以改善小鼠的抑郁样行为。

5．自主跑轮运动对甲醛模型小鼠海马新生神经元标记物DCX的影响

One-wayANOVA显示，自主跑轮运动可以促进甲醛模型小鼠海马的神经再生[F(2,69)=12.73,P<0.001图6]。与NS组(250.90±16.22)相比，F组小鼠(210.90±7.98)海马齿状回区DCX阳性细胞面积明显减少(P<0.05);与F组相比，R+F组小鼠(284.00±9.84)的DCX阳性细胞面积明显增加(P<0.001)。

讨论

感觉分辨和情绪体验是疼痛的两个基本成分[16,17]。疼痛相关的负性情绪体验可以增强痛觉的敏感性，与疼痛的发生发展密切相关[11]。但对疼痛相关的负性情绪体验缺乏有效治疗方法。甲醛疼痛模型是模拟临床炎性痛的经典模型[18]。本实验自发痛行为学结果显示，右后爪足底皮下注射甲醛可以诱导小鼠舔咬足的累计时间出现两个高峰，与文献报道一致[18]。有研究发现，足底注射甲醛也可以诱发小鼠焦虑样行为[19]。我们的实验数据显示，甲醛注射小鼠在旷场中央格探索时间减少，进入高架开放臂的时间减少，表明F组小鼠伴随焦虑样行为。与此同时，被迫游泳实验数据表明，F组小鼠还伴随有抑郁样行为，但预先给予小鼠自主跑轮运动3周，可以缓解小鼠甲醛所致的疼痛以及疼痛相关的焦虑和抑郁样行为。在旷场实验中各组小鼠均表现出正常的自主活动和探索能力，排除了活动能力和探索行为改变对抑郁行为检测结果的干扰。

海马作为情绪整合的中枢，参与调节焦虑和抑郁等情感障碍[20]，同时与疼痛也密切相关[21]，海马神经发生受损可以促进焦虑和抑郁的发生[22,23]。自主跑轮运动作为一种无创、低成本的干预手段可以增加幼龄鼠、中年鼠甚至老龄鼠海马的神经发生[24,25]。我们采用免疫组织化学方法检测小鼠海马新生神经元标记物DCX的表达，结果显示，F组小鼠海马DCX阳性细胞数目减少，而R+F组DCX阳性细胞数目增加。提示，自主跑轮运动改善甲醛所致的疼痛和负性情绪很可能与其保护海马的神经发生有关。综上所述，自主跑轮运动可能通过上调海马的神经发生减轻甲醛所致的疼痛及其焦虑、抑郁样情绪。但是海马神经发生是否是疼痛及痛性情绪的共同调节机制还有待进一步研究。