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小胶质细胞活化对脑缺血再灌注大鼠缺血区域神经元树突棘影响

2024-10-26 88 上传者：管理员

摘要：目的探究小胶质细胞活化对脑缺血再灌注(CIR)大鼠缺血区域神经元树突棘的影响。方法 60只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、假手术+集落刺激因子1受体(CSF1R)抑制剂PLX5622组、模型组、模型+PLX5622组各15只。CIR模型构建前14 d,通过含PLX5622的鼠粮饮食敲低假手术+PLX5622组与模型+PLX5622组脑组织中小胶质细胞含量。采用线栓法阻塞中动脉血流，2 h后拔出线栓模拟患者CIR损伤过程，24 h后开展神经功能评分、Morris水迷宫测试。取大鼠脑组织分别进行2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、高尔基、免疫荧光染色与Western印迹检测。结果与假手术组相比，假手术+PLX5622组脑组织中离子化钙结合适配分子(iba)1蛋白表达明显减少(P<0.001),但神经功能评分和Morris水迷宫指标未见明显差异，且脑组织中未见梗死区域，神经元树突棘未见明显差异(P>0.05);而模型组脑组织中iba1蛋白表达明显增加，神经功能评分明显增加，Morris水迷宫中首次到达平台时间明显延长、穿越平台次数明显减少、目标象限停留时间显著缩短(P<0.01,P<0.001);模型组脑组织中出现明显梗死区域，炎症信号通路相关蛋白Nod样受体蛋白(NLRP)3与p-核因子(NF)-κB蛋白表达明显增加，神经营养相关蛋白脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体(Trk)B蛋白表达明显减少，神经元树突棘密度明显降低(P<0.05,P<0.001);与模型组相比，模型+PLX5622组脑组织中iba1蛋白表达明显减少，神经功能评分明显降低，Morris水迷宫中首次到达平台时间明显缩短，穿越平台次数明显增加、目标象限停留时间明显延长，脑组织中白色梗死区域占比明显减少，NLRP3与p-NF-κB蛋白表达明显减少，BDNF、TrkB蛋白表达与神经元树突棘密度明显增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论 PLX5622敲低大鼠脑组织中小胶质细胞能够减少神经元树突棘丢失，避免BDNF和TrkB蛋白表达降低，发挥减轻CIR造成的神经功能损伤作用，提高记忆能力。

关键词：
小胶质细胞
树突棘
神经功能
脑缺血再灌注
记忆功能
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脑缺血再灌注(CIR)损伤是缺血性脑卒中患者溶栓后常见的继发性损伤[1]。大脑海马体极易受CIR影响，会造成患者神经功能损伤、情绪失控和决策能力丧失，甚至导致半身不遂的症状[2]。

中枢神经系统内小胶质细胞发挥着免疫相关稳态平衡维持与细胞吞噬功能。小胶质细胞活化是生物体面对应激反应和毒素入侵的一类内源性保护机制[3]。然而，过度活化的小胶质细胞不仅会吞噬损伤的细胞器和衰老的神经元，还会攻击正常神经元，产生有害且无法调控的炎症反应。不同文献中显示，CIR过程中常伴有大量氧化因子入侵，诱发小胶质细胞过度活化，介导炎症反应[4,5]。此外，也有研究报道，CIR会影响神经突触的结构与功能[6]。然而，CIR损伤中小胶质细胞活化与神经元树突棘功能之间的关联尚鲜有研究探索。本研究探讨小胶质细胞活化对CIR大鼠缺血区域神经元树突棘的结构与功能的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物

60只SPF级雄性SD大鼠，由海南药物研究所有限责任公司提供，周龄7～8 w,体质量170～180 g,饲养于海南医学院动物实验中心SPF级动物房。

1.2实验材料

集落刺激因子1受体(CSF1R)抑制剂PLX5622(美国MCE公司，批号：h7832);脑缺血模型线栓(广州佳灵生物技术公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色试剂盒(北京索莱宝公司);高尔基染色试剂盒(美国Thermo公司);免抗离子化钙结合适配分子(iba)1、CSF1R、p-核因子(NF)-κB、NF-κB、Nod样受体蛋白(NLRP)3、突触蛋白(Synapsin)1、脑源性神经营养因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体(Trk)B和β-actin抗体(英国Abcam公司、北京博奥森生物技术公司、武汉博士德生物技术公司)。

1.3实验方案

所有大鼠经检疫3 d,合格后入组。将大鼠以体质量为分组指标，随机分为假手术组、假手术+PLX5622组、模型组、模型+PLX5622组。CIR模型构建前14 d,假手术+PLX5622组与模型+PLX5622组喂食PLX5622鼠粮(每千克鼠粮含PLX5622 1 200 mg)。CIR模型构建前4 d,开展Morris水迷宫训练。取模型组与模型+PLX5622组构建CIR模型，24 h后，所有大鼠开展神经功能评分，再进行Morris水迷宫测试。行为学评估结束后，每组取3只麻醉处死后取材进行TTC染色。每组取6只大鼠经麻醉后心脏灌流、取材，取脑组织分别用于高尔基染色与免疫荧光染色。剩余大鼠麻醉后处死，取脑组织用于Western印迹检测。

1.4 Morris水迷宫测试

Morris水迷宫分为训练期与测试期。训练期，将大鼠依次面向各个象限壁，缓慢放入水中，自由游泳以期寻找目标象限中逃生平台，记录到达平台时间。测试期撤去逃生平台，大鼠在水迷宫中自由游泳，记录90 s内游泳轨迹，经软件分析大鼠首次到达平台时间、穿越平台次数与目标象限停留时间。

1.5 CIR模型构建[7]与神经功能评分

取模型组与模型+PLX5622组大鼠，经30 mg/kg戊巴比妥钠溶液麻醉，将大鼠仰卧位固定在恒温手术台上。沿大鼠颈部中线皮肤备皮、消毒、开口。通过钝性玻璃分针、镊子分离出左侧3条颈动脉(颈总动脉、颈外动脉与颈内动脉)。选用缝合线将颈总动脉与颈外动脉结扎、止血。提拉起颈总动脉穿刺，经伤口插入脑缺血模型线栓(约16 mm),前进至颈内动脉，阻断大脑中动脉血流。2 h后取出线栓，止血、缝合。假手术组仅麻醉、备皮、消毒切口，分离左侧颈动脉后缝合。根据参考文献[8]中方案，通过不同行为学观察实验评估神经功能。行为学观察实验包括悬尾实验、运动实验、感觉实验、平衡木实验、反射实验和非正常运动评价。每项结果评分为0～4分，神经功能损伤严重程度与评分结果呈正相关，最高评分为18分。

1.6 TTC染色

将脑组织放入-80℃环境中冷冻5 min至坚硬，沿冠状面切成6片，厚度1～2 mm。取切片浸没入2% TTC染色液中，避光水浴30 min,温度37～39℃。取出切片按顺序排列，摄像机拍摄后保存，经软件处理获得缺血区与非缺血区面积占比，以缺血区面积占总面积比值(%)作为统计数据。

1.7高尔基染色

大鼠麻醉处死后用预冷生理盐水心脏灌流，冲净血液，取出脑组织。根据试剂盒说明书进行高尔基染色(以下提及溶液1、2、3、4、5均是试剂盒中溶液代称)。将溶液1与溶液2等比混合，埋入脑组织冷藏14 d。转移脑组织至溶液3中继续冷藏2 d。取脑组织埋入异戊烷中，冷冻后沿冠状面切成约10μm厚切片。将切片固定在载玻片，使用溶液4与溶液5等比混合溶液，滴加在切片上反应30 min。蒸馏水清洗切片，梯度酒精脱水，再经间/邻二甲苯溶液透化。将切片放在激光共聚焦显微镜下观察，收集树突图像，分析统计树突棘密度。

1.8免疫荧光染色

将冷冻切片固定载玻片上，滴加山羊血清封闭。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗切片，表面滴加兔源抗鼠iba1抗体稀释液(1∶200),湿盒中(4℃)孵育过夜。PBS清洗切片，表面滴加Dylight488羊抗兔二抗稀释液(1∶500),避光孵育1 h。使用PBS清洗切片，以滤纸吸干表面液体，表面滴加抗荧光猝灭剂，暗室中使用荧光显微镜观察脑组织中iba1蛋白表达，通过计算机拍摄记录。

1.9 Western印迹

取海马组织，加入裂解液制成单细胞悬液，离心(12 000 r/min, 10 min)后取上清。上清液中加入上样缓冲液，沸水(10 min)制成样品。取10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)液，根据样品蛋白浓度，吸取约10μg样品在加入各个样品孔中。开启SDS-PAGE,设置条件为恒压30 V/30 min, 90 V/90 min,以上样缓冲液到达凝胶底部为电泳终点。取出SDS-PAGE凝胶，通过湿法转移凝胶上蛋白至膜上，设置条件恒流2 A/60 min。取蛋白膜以PBST清洗表面，放入牛血清白蛋白(BSA)溶液中室温封闭2 h。将封闭后蛋白条带以PBST清洗，表面滴加一抗稀释液(1∶1 000～1∶2 000)孵育过夜。次日取出蛋白膜，以PBST清洗，再滴加辣根过氧化物酶(HRP)羊抗兔二抗抗体稀释液(1∶5 000)室温孵育2 h。取出蛋白膜以PBST清洗，表面滴加超敏化学发光液后，化学发光成像仪中显影成像。收集成像图片，通过ImageJ软件分析、量化各蛋白灰度值。将目的蛋白与β-actin蛋白灰度值相比获得相对表达结果。

1.10统计学分析

采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、Tukey检验。

2、结果

2.1 CIR模型构建

假手术组仅打开颈部皮肤，分离出颈动脉，未进行其他处理，大鼠行为学基本正常，仅有两只在平衡木实验中评为1分；假手术组与假手术+PLX5622组神经功能未见明显异常。与假手术组相比，模型组神经功能评分明显升高(P<0.001),存在右侧前肢蜷曲、无法延伸、抓握能力与平衡能力降低等情况，且部分大鼠出现非正常运动。此外，假手术组与假手术+PLX5622组脑组织中未见白色梗死区域；与假手术组相比，模型组出现明显梗死区域(P<0.001);与模型组相比，模型+PLX5622组神经功能评分明显降低，且脑梗死区域占比明显减少(P<0.001)。见图1、表1。

2.2 CIR造成大鼠记忆能力损伤

与假手术组相比，模型组首次到达平台时间明显延长，穿越平台次数明显减少，目标象限停留时间明显缩短(P<0.01,P<0.001),而假手术+PLX5622组各项指标未见明显差异(P>0.05);与模型组相比，模型+PLX5622组首次到达平台时间缩短，穿越平台次数增加，目标象限停留时间延长，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表1。

2.3 CIR造成小胶质细胞活化及神经突触丢失

与假手术组相比，假手术+PLX5622组脑组织中iba1蛋白表达明显降低(P<0.001),神经元树突棘密度虽然部分增加，但未见明显差异(P>0.05);而模型组脑组织中iba1蛋白表达明显升高，树突棘密度明显减少(P<0.001);与模型组相比，模型+PLX5622组脑组织中iba1蛋白表达明显减少，树突棘密度明显升高(P<0.001)。见表1、图2、图3。

图1各组脑梗死

表1各组神经功能评分、脑梗死区域占比、首次到达平台时间、穿越平台次数、目标象限停留时间、脑组织中iba1蛋白表达及神经元树突棘密度比较

图2各组脑组织中iba1蛋白表达(免疫荧光，×50)

2.4神经突触丢失与CSF1R调控的炎症信号通路和神经营养相关通路相关

因长期PLX5622饮食干预，相比于假手术组，假手术+PLX5622组脑组织中CSF1R蛋白表达明显降低(P<0.05),但神经炎症和神经营养相关蛋白表达未见明显差异(P>0.05);而模型组脑组织中CSF1R、NLRP3、p-NF-κB蛋白表达明显升高，Synapsin1、BDNF与TrkB蛋白表达明显降低(均P<0.05);与模型组相比，模型+PLX5622组脑组织中CSF1R、NLRP3、p-NF-κB蛋白表达明显降低，Synapsin1、BDNF与TrkB蛋白表达明显升高(P<0.05)。见表2、图4。

图3各组脑组织神经元树突棘(高尔基染色，×200)

表2各组脑组织中炎症信号通路和神经营养相关蛋白相对表达比较

图4各组脑组织中炎症信号通路和神经营养相关蛋白表达

1～4:假手术组、假手术+PLX5622组、模型组、模型+PLX5622组

3、讨论

CIR损伤是指缺血区恢复血流后，脑组织中损伤进一步加重的现象，大鼠中动脉栓塞复灌是目前应用最广泛的模型[7]。本研究结果与既往文献中报道一致，与临床患者常见的四肢失调、半身不遂等症状[9]相似。此外，模型组缺血侧均可见显著白色梗死区域，该结果与临床患者CT检查常见低密度、偏灰色造影结果一致[10]。同时，结果提示动物记忆功能损伤，这与临床患者远期记忆功能损伤结果一致[11]。说明CIR大鼠模型构建成功，可以用于后续研究。

小胶质细胞属于神经系统固有免疫细胞，通常处于静息状态，发挥内环境检测，抑制神经毒性，参与树突棘结构修饰，增强突触可塑性的神经保护作用[12]。CIR发生后1 h内，小胶质细胞首先作出免疫应答，其胞体会膨胀，突起及分支增加，接触、识别并清除缺血区坏死病灶，产生内源性保护作用[13]。之后小胶质细胞活化不断增强，导致神经炎症，造成神经元损伤[14]。据文献介绍，脑缺血后小胶质细胞分支与神经元树突棘接触时间和频率会明显增加，而接触后的树突棘会消失，影响神经元突触之间信号传递[15]。揭示了过度活化的小胶质细胞会吞噬神经元树突棘，导致大鼠神经元突触可塑性损伤。而突触可塑性损伤则是造成CIR患者预后学习、记忆能力损伤的重要原因[16]。

CSF1R是小胶质细胞膜上表达的一类跨膜糖蛋白，具有维持细胞稳态、调控小胶质细胞发育、促进小胶质细胞成熟与生存功能[17]。研究表明，小胶质细胞的生存严重依赖CSF1R信号传导，对于CSF1R-/-小鼠，其脑组织中小胶质细胞数量仅为正常小鼠的6%,小胶质细胞完全失去分支与突起，表现为圆球状细胞，而且该品系表现出极差抗感染能力与极低的生存能力[18]。近年来，不少团队确定了口服CSF1R抑制剂PLX5622能够穿透血脑屏障，数天内便可消除全脑小胶质细胞[19]。本研究结果提示，通过CSF1R抑制剂PLX5622可成功敲低大鼠脑组织中小胶质细胞含量。此外，PLX5622干预不仅抑制了小胶质细胞活化，减少了对树突棘的吞噬，而且诱导了大鼠脑组织中BDNF与TrkB蛋白表达增加，共同促进了脑组织中Synapsin1蛋白与树突棘密度增加。最终介导模型+PLX5622组神经功能评分减少，Morris水迷宫中首次到达平台时间明显缩短，穿越平台次数增加，目标象限停留时间延长。

综上，小胶质细胞对神经元树突棘的生存具有显著影响。虽然PLX5622敲低脑组织中小胶质细胞可能会消除生物体内源性保护机制，但是PLX5622也同样降低了小胶质细胞过度活化诱发的炎症反应通路过度活化。此外，小胶质细胞的敲低能够避免BDNF和TrkB蛋白表达降低，保证了树突棘生长所需细胞营养因子。以上这些因素协同避免了神经元树突棘的丢失，减轻神经功能损伤，提高了记忆能力。

参考文献:

2王欢欢,王刚,仲婷婷,等.脑原位缺血预处理通过Nrf2/HO-1信号通路减轻大鼠缺血再灌注损伤[J].中国老年学杂志,2021;41(7):1477-81.

9许朝卿,孙鑫海,舒龙,等.银杏达莫联合丁苯酞治疗缺血性脑卒中后认知功能障碍患者的临床研究[J].中国临床药理学杂志,2021;37(14):1846-50.

10张哲宇,徐良额,江秉泽,等.基于CT灌注成像评估侧支循环在急性缺血性脑卒中取栓前后脑梗死进展及预后评估中的应用[J].中华神经医学杂志,2021;20(1):8-15.

基金资助:海南省卫生健康行业科研项目(21A200315);

文章来源:黄钰婷,周升,黄佳丽,等.小胶质细胞活化对脑缺血再灌注大鼠缺血区域神经元树突棘的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(20):5005-5009.