补肾活血方对慢性脑低灌注小鼠髓鞘及认知功能的改善作用

2025-08-12 57 上传者：管理员

摘要：目的研究临床经验复方补肾活血方对慢性脑低灌注(chroniccerebralhypoperfusion,CCH)小鼠髓鞘以及认知功能的影响。方法选择30只无特定病原体级雄性C57BL/6J小鼠，按照随机数字表分为假手术组8只和手术组22只。手术组应用微弹簧双侧颈总动脉狭窄法构建CCH小鼠模型。假手术组小鼠仅分离双侧迷走神经。手术组22只小鼠术后2d共死亡6只，其余16只成活小鼠按随机数字表法分为模型组及治疗组，每组8只。手术2周后治疗组给予补肾活血方中草药汤剂0.2ml/d灌胃，假手术组及模型组给予等体积纯水灌胃，连续灌胃60d。采用Morris水迷宫实验评价各组小鼠认知功能的变化，采用MRI检测弥散张量成像-分数各向异性(diffusiontensorimaging-fractionalanisotropy,DTI-FA)评价小鼠脑白质病变，采用劳克坚牢蓝(Luxolfastblue,LFB)染色观察胼胝体区脱髓鞘情况，采用尼氏染色观察海马CA1区神经元损伤情况。结果与假手术组比较，模型组小鼠Morris水迷宫第5天游泳距离及逃避潜伏期显著延长、穿越平台次数、DTI-FA值、LFB染色髓鞘吸光度值、尼氏染色海马区神经元数量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与模型组小鼠比较，治疗组Morris水迷宫第5天游泳距离[188.14(105.19,342.00)cmvs280.22(168.47,501.37)cm,P<0.05]、逃避潜伏期第5天[10.22(5.77,19.47)svs19.39(13.57,31.09)s,P<0.01]显著缩短，穿越平台次数[3.00(2.00,4.00)次vs2.00(1.00,3.00)次，P<0.05]、DTI-FA值(0.34±0.01vs0.31±0.01,P<0.01)、LFB染色髓鞘吸光度值[0.353(0.328,0.364)vs0.305(0.290,0.350),P<0.05]以及尼氏染色神经元数量明显升高，差异有统计学意义[(9.94±2.22)个vs(7.11±2.02)个，P<0.01]。结论补肾活血方可以通过修复白质微结构、挽救神经元丢失，并且改善CCH小鼠的认知功能障碍。

关键词：
活血
痴呆
缺氧
脑血管疾病
血管性
补肾
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血管性认知障碍(VascularCognitiveImpairment,VCI)占全球痴呆病例的20%~40%,是仅次于阿尔茨海默病的第二大痴呆类型[1-2]。据报道,我国65岁以上认知障碍患者中,42%与脑血管疾病及血管风险因素相关[3]。慢性脑低灌注(chroniccerebralhypoperfusion,CCH)作为VCI的重要危险因素,通过诱导细胞凋亡、氧化应激、炎性反应、血脑屏障破坏以及胶质细胞活化等多重机制引发脑白质损伤和认知功能损害[4-10]。有研究结果表明,脑白质病变是CCH致VCI的关键病理环节[11-13]。研究发现,脑白质高信号体积的进展与认知能力下降显著相关[14-16]。因此,修复脑白质损伤可能是延缓VCI的策略之一。

中医药基于“整体观”和“辨证论治”理论,在促进血管新生、改善血流动力学方面展现出独特优势[17-19]。中医认为,VCI多属“肾虚血瘀”范畴,补肾活血类复方可以通过“益肾填髓、活血化瘀”的调控作用,有效干预CCH相关病理进程[20-21]。因此,本研究应用具有补肾活血功效的临床经验中药复方干预CCH模型小鼠,通过行为学、影像学及病理学等评价其对认知功能及白质微结构的影响,以期为血管性痴呆的临床治疗提供实验依据及新策略。

1、材料与方法

1.1动物

30只无特定病原体级雄性C57BL/6J小鼠,体质量为28~32g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXY(北京)2019-0010]。饲养于北京中医药大学动物实验室屏障环境动物室[SYXK(京)2009-0028]。温度(24±1)℃,相对湿度55%±5%,光线12h/12h(08:00/20:00)光照/黑暗周期。给予充足清洁饮水、摄食。饲养遵循动物伦理和福利原则(BUCM-4-2022061602-2105)。

1.2分组与造模

实验小鼠按照随机数字表法分为假手术组8只和手术组22只。手术组应用微弹簧双侧颈总动脉狭窄(Bilateralcommoncarotidarterystenosis,BCAS)法构建CCH小鼠模型[22]。假手术组小鼠仅分离双侧迷走神经,随后缝合消毒。假手术组8只小鼠均手术成功。手术组22只小鼠术后2d死亡6只,其余16只成活小鼠按随机数字表法分为模型组及治疗组,每组8只。

1.3药物制备及给药方法

手术2周后治疗组给予补肾活血方中草药汤剂0.2ml/d灌胃,假手术组及模型组给予等体积纯水灌胃,连续灌胃60d。补肾活血方中草药均购自北京中医药大学东直门医院。按照成人给药剂量[1副/(60kg·d)]进行等比例换算每只小鼠给药剂量[0.27副/(kg·d)],按照0.2ml/(只·d)的灌胃剂量将中草药熬制为中药汤剂100ml/副。

1.4Morris水迷宫

灌胃60d后进行Morris水迷宫实验[23]。使用奶粉使池水变白以隐藏水面下1cm处的平台。水池分为4个象限,在平台处目标象限外的3个象限的中点处将小鼠面朝池壁放入水中,从入水到登陆平台的时间为逃避潜伏期。记录测试第1~5天小鼠游泳距离和逃避潜伏期。测试第6天,移除平台,记录60s内小鼠穿过原平台位置的次数。

1.5MRI检测

在MRI检测快速自旋回波脉冲序列进行弥散张量成像(diffusiontensorimaging,DTI)序列中,分数各向异性(fractionalanisotropy,FA)反映水分子扩散的方向性,常用于评估脑白质纤维的完整性,FA值降低表明白质纤维结构紊乱,FA值越低,脑白质损伤越严重[24-25]。

灌胃后60d各组小鼠取3只进行小动物DTI序列核磁扫描(型号:Bruke9.4TMicroMRI)。小鼠经鼻吸入异氟烷进行麻醉,麻醉成功后,取俯卧位,头部置于线圈中央进行全脑扫描。DTI扫描参数为:重复时间1500.0ms,回波时间20ms,视野:14mm×10mm,层厚:0.5mm,扫描时间:7min。利用DTI_Studio软件获得FA图,使用DTI_Studio软件,在每只小鼠的FA图上手动追踪胼胝体区作为感兴趣区测定其FA值。

1.6劳克坚牢蓝(luxolfastblue,LFB)染色

采用LFB染色观察胼胝体区脱髓鞘情况。各组小鼠取3只经异氟烷麻醉,经心脏灌注固定取脑、石蜡包埋、冠状切片,切片厚度4μm。取胼胝体部位石蜡切片,脱蜡至水,放入LFB溶液60℃烘箱浸染4h,蒸馏水清洗后,经乙醇-碳酸锂水溶液分色。乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。光学显微镜下观察并拍照,使用ImageJ对胼胝体区域吸光度值进行统计。

1.7尼氏染色

每只小鼠取海马部位石蜡切片,脱蜡至水,亚甲蓝染色10min,尼氏分化液分色。乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。光学显微镜下观察海马CA1区神经元并拍照,在高倍视野中进行神经元计数。

1.8统计学方法

采用SPSS20软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x