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IL-33/ST2信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护机制

2025-06-02 65 上传者：管理员

摘要：目的探讨白细胞介素(IL)-33/IL-33受体(ST2)信号系统对脑缺血再灌注损伤神经保护作用｡方法采用线栓法制作右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)脑缺血再灌注大鼠模型｡将40只健康成年SD大鼠随机分为模型组30只和假手术(Sham)组10只,再将模型组随机分配到MCAO组､IL-33-24h组和IL-33-15d组各10只｡IL-33-24h组IL-33-15d组按时间点给予皮下注射0.1mg/kgIL-33｡MCAO组给予皮下注射0.1mg/kg0.9%氯化钠注射液｡取标本:大鼠断头取脑后用0.9%氯化钠溶液冲洗｡每组各取5只大鼠,共取3次,分别进行全脑TTC染色､TUNEL染色和免疫组织化学观察,Western印迹检测IL-33､ST2､B细胞淋巴瘤(Bcl)-2､Bcl-2相关X蛋白(Bax)､含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3蛋白的表达｡结果成功建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,与Sham组比较,MCAO大鼠模型中IL-33､ST2通路受到抑制｡MCAO组IL-33､ST2､Bcl-2/Bax表达比例显著下调,Caspase3明显上调(P<0.05);TTC染色结果发现IL-33治疗后可减少给药组大鼠脑梗死体积,且呈现时间依赖性(P<0.05)｡与Sham组比较,MCAO组神经元细胞凋亡率增加明显(P<0.05),而给药组神经元细胞凋亡率显著减少,且呈现时间依赖性(P<0.05)｡结论大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后应用IL-33治疗能够对大脑皮层神经细胞凋亡进行调控｡并可减少脑缺血再灌注损伤所致梗死面积｡

关键词：
白细胞介素(IL)-33/IL-33受体(ST2)信号通路
神经保护
神经细胞凋亡
脑缺血再灌注损伤
血液供应
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缺血区域血液供应是否及时恢复是治疗急性缺血性脑血管病的基本原则〔1〕｡近年来国内外学者较多的研究兴趣集中在脑缺血再灌注后的炎性反应过程｡而脑缺血后再灌注损伤后神经细胞凋亡是造成神经功能缺损的重要机制之一〔2〕｡白细胞介素(IL)⁃33/IL⁃33受体(ST2)信号系统通过胞内信号转导,参与脑缺血再灌注损伤后的炎症和免疫反应〔3〕｡本研究主要探讨脑缺血再灌注损伤中IL⁃33剂量依赖对神经细胞凋亡的调控,揭示IL⁃33/ST2信号系统通过胞内信号转导对神经组织起到保护作用,为缺血再灌注损伤机制的研究提供了新的线索｡

1、材料与方法

1.1主要试剂及设备

2,3,5⁃氯化三苯基四氮唑(TTC)染液(美国Sigma公司),大脑中动脉闭塞(MCAO,中国瑞沃德公司),IL⁃33(美国MedChe⁃mExpress公司),TUNEL检测试剂盒(美国Roche公司)｡抗B细胞淋巴瘤(Bcl)⁃2相关X蛋白(Bax)抗体,抗Bcl⁃2抗体,抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3抗体,抗ST2抗体,线栓(北京鼎国生物公司),ImageJ图像分析软件(美国NIH),荧光倒置显微镜(美国赛默飞公司),十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS⁃PAGE)装置(美国Bio⁃Rad公司);化学发光成像仪等｡

1.2实验动物

SPF级健康雄性大鼠〔10~12周龄,体质量(220±20)g〕购于北京维通利华公司(动物伦理编号:20200500)

1.3大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的建立

MCAO模型使用线栓法建立〔1〕｡大鼠用1%戊巴比妥钠(0.4ml/100g)麻醉并固定在仰卧位｡常规消毒,沿颈部中线切开后钝性分离颈总动脉(CCA),游离CCA至分叉处,同时结扎CCA和颈外动脉(ECA),用血管动脉夹夹闭颈内动脉(ICA)｡于CCA将线栓插入,使线栓沿CCA插入ICA约18mm处阻断血管｡假手术(Sham)组单纯分离CCA､ICA和ECA｡彻底止血后逐层缝合并将大鼠放回饲养笼,保持使用加热垫以维持动物温度在37℃｡

1.4动物实验分组

获取Sham组大鼠10只,将成功构建的MCAO大鼠(共30只)随机分配到MCAO组､IL⁃33⁃24h组､IL⁃33⁃15d组各10只｡其中IL⁃33⁃24h组大鼠为脑缺血再灌注损伤术后24h内给予皮下注射0.1mg/kgIL⁃331次;IL⁃33⁃15d组为脑缺血再灌注损伤术后前3d给予皮下注射0.1mg/kgIL⁃33,1天1次,此后每3天给予1次,共给药15d｡MCAO组给予皮下注射0.1mg/kg0.9%氯化钠注射液｡

1.5TTC染色及脑梗死密度测量

TTC染色:参照文献〔4〕大鼠麻醉后断头取脑组织快速冷冻,做冠状面切片,每片厚约2mm;将切片放入2%TTC溶液中再放到37℃恒温箱中避光染色30min｡正常脑组织染色呈红色,脑梗死灶染色呈苍白色｡梗死面积测量:参照文献〔5〕将染色切片照相后用ImageJ分析梗死体积,梗死体积百分比=(白色梗死面积×厚度)/(全层面积×厚度)×100%｡

1.6TUNEL染色

采用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况,固定后的脑片(10μm厚度)使用TUNEL检测试剂盒按照制造商的说明进行测量｡细胞核用4′,6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚(DAPI)染色,然后评估TUNEL染色｡DAPI和TUNEL双标记的细胞核被视为凋亡细胞｡凋亡细胞的细胞核呈褐色,高倍镜(×400)视野下计算阳性细胞数｡

1.7Western印迹

采用Western印迹法检测右侧大脑皮层缺血半暗带中蛋白表达｡使用研钵将脑组织置于液氮中捣碎,取样本20~50mg,经组织研磨､匀浆､提取总蛋白;再行二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度的测定,稀释样品后加入上样缓冲液制成蛋白样品｡凝胶电泳､将蛋白转印至硝酸纤维素(NC)膜､5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1h｡将膜与抗Bcl⁃2､抗Bax､抗Caspase⁃3(ab182858､ab32503､ab32351,abcam,1∶1000)及抗β⁃actin(ab6276,abcam,1∶5000)在4℃过夜｡PBST清洗后进行灰度分析｡

1.8统计学分析

采用SPSS27.0和GraphPadPrism9.5软件进行统计分析及图片绘制｡计量资料符合正态分布的数据采用LSD⁃t检验｡

2、结果

2.1MCAO

模型中IL⁃33/ST2通路抑制与Sham组〔(29.89±2.03)%､(39.37±1.40)%〕比较,MCAO组缺血侧脑内IL⁃33〔(13.17±1.60)%)､ST2阳性表达〔(21.19±1.81)%〕明显减少(t=29.87､34.16,均P<0.05)｡见图1｡Western印迹结果表明,与Sham组比较,MCAO组IL⁃33､ST2､Bcl⁃2/Bax蛋白表达显著下调,Caspase3表达显著上调(P<0.05)｡见表1､图2｡

图1免疫组织化学染色观察两组脑组织IL⁃33､ST2阳性表达

表1两组脑组织IL⁃33､ST2､Bcl⁃2/Bax､Caspase3蛋白表达比较

2.2IL⁃33治疗可减少脑卒中大鼠梗死体积并改善其神经功能

TTC染色结果发现,造模组脑组织切片有明显的缺血梗死灶,梗死部位呈白色,正常部位组织染色为红色｡与此同时,造模大鼠在自发活动中出现倾斜､绕圈或跌倒症状｡脑组织梗死体积测定结果,与Sham组比较,MCAO组的脑梗死体积比例升高,差异具有统计学意义(P<0.05),提示MCAO大鼠模型建立成功｡与MCAO组比较,IL⁃33⁃24h､IL⁃33⁃15d组脑梗死体积比例显著降低,且呈现显著时间依赖性(均P<0.05)｡见表2､图3｡

图2Western印迹检测两组脑组织中IL⁃33､ST2､Bcl⁃2､Bax及Caspase⁃3蛋白表达

表2各组脑组织梗死体积､细胞凋亡率､TUNEL法检测阳性细胞数值比较

2.3IL⁃33治疗可减少MCAO模型细胞凋亡

神经元细胞凋亡TUNEL法检测结果显示:与Sham组比较,MCAO组神经元细胞凋亡率及TUNEL阳性细胞数增加,差异具有统计学意义(P<0.05);IL⁃33⁃24h､IL⁃33⁃15d组较MCAO组神经元细胞凋亡率及TUNEL阳性细胞数显著减少,且呈现显著时间依赖性(均P<0.05)｡见表2､图4｡

图3各组脑组织TTC染色及梗死体积

图4TUNEL染色检测各组神经细胞凋亡

3、讨论

缺血性脑损伤的病理过程受多种因素影响〔6〕,其中重要的病理变化之一是免疫反应,目前有望成为治疗脑梗死的新靶点｡IL⁃33是IL⁃1家族成员,IL⁃33作为细胞因子本身具有双重性〔7,8〕｡即参与抗炎反应调节机体免疫,又可导致炎性反应｡缺血再灌注损伤是指在急性缺血缺氧状态下部分或者全部恢复器官组织血供后反而进一步加重损伤的过程｡

以往研究可知炎性因子与缺血再灌注损伤关系密切,IL⁃33就是其中之一〔9,10〕｡研究〔11,12〕发现,脑缺血损伤后1h,在少突胶质细胞和星形胶质细胞中IL⁃33的表达迅速增加｡ST2在信号通路中发挥关键作用〔13~15〕,通过ST2-/-小鼠骨髓源性巨噬细胞发现,受体ST2在IL⁃33对泡沫细胞形成中起重要作用｡脑梗死患者外周血Th17与预后相关〔16~18〕｡因此,神经保护既可预防Th1和Th17反应,进而可能改善脑卒中预后〔19〕,并提示IL⁃33可能成为脑卒中治疗的新靶点〔20〕｡肖伟等〔21〕针对IL⁃33在脑缺血再灌注损伤过程中的作用进行了动物实验研究,研究通过检测MCAO模型小鼠不同时间点所受缺血再灌注损伤的脑组织中IL⁃33mRNA与ST2mRNA数量,发现它们总体均呈现下降趋势,提示IL⁃33/ST2传导通路在脑缺血再灌注损伤过程中可能发挥重要作用｡Pomeshchik等〔22〕通过建立小鼠脊髓外伤动物模型,应用重组IL⁃33治疗后首次证实了IL⁃33的调控对中枢神经系统创伤起到神经保护作用｡罗艺〔7〕针对IL⁃33与急性期脑梗死进行动物实验研究,初步得出结论IL⁃33对缺血性脑组织可能起到神经保护作用｡

综上,IL⁃33与缺血性脑损伤作用机制的研究可以为临床治疗提供新方法｡本研究探讨IL⁃33在脑缺血再灌注损伤动物模型脑内的表达变化,为神经保护机制作用及治疗提供参考｡

参考文献:

1闫换.大鼠线栓法大脑中动脉闭塞模型改进的实验研究〔D〕.苏州:苏州大学,2011.

3雷蕾,周志斌,姜丹,等.高压氧治疗对于急性脑梗死患者外周血单核细胞Toll样受体4的表达及预后的影响〔J〕.安徽医药,2015;20(3):508⁃11.

4唐湘祁.NADPH氧化酶调节MMP⁃9和E选择素表达与缺血再灌注脑损伤的病理机制〔D〕.长沙:中南大学,2011.

5胡睿瑶.IL⁃33/ST2轴活化Treg细胞对缺血性脑卒中的神经保护作用〔D〕.郑州:郑州大学,2019.

6赵文彦,钟佳雯,观佩君,等.IL⁃33在脑缺血再灌注小鼠脑内的表达和细胞定位〔J〕.神经解剖学杂志,2019;35(1):52⁃6.

7罗艺.IL⁃33促进Th2应答和抑制Th17应答的效应能够缓解小鼠缺血性脑损伤〔D〕.武汉:华中科技大学,2014.

8石瑜,李可,刘秋红.血清IL⁃33对急性缺血性脑卒诊断及预后的临床价值〔J〕.齐齐哈尔医学院学报,2018;39(22):2617⁃20.

基金资助: 吉林省科技厅项目(20210101465JC);

文章来源:刘晶瑶,门玉娇,朱辉,等.IL-33/ST2信号通路对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经保护机制[J].中国老年学杂志,2025,45(10):2480-2483.