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维生素D介导MEK/ERK通路对妊娠糖尿病大鼠心肌损伤的影响

2024-04-15 43 上传者：管理员

摘要：目的研究维生素D介导丝裂原激活蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路对妊娠糖尿病大鼠心肌损伤的影响。方法将SD大鼠分为对照组、模型组和低、中、高剂量实验组。除对照组外，各组建立妊娠糖尿病大鼠模型。造模成功后，低、中、高剂量实验组分别灌胃给予0.05、0.10、0.15μg•kg-1的维生素D,对照组、模型组均灌胃等量0.9%NaCl,每天1次，连续灌胃2周。检测干预前和干预后1周、2周空腹血糖浓度、胰岛素水平，以超声心动图检测心功能[左心室射血分数(LVEF)、左心室内压最大上升速度(+dp/dtmax)和最大下降速度(-dp/dtmax)],以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测大鼠血清和心肌组织中心肌酶指标[肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)]、炎性因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)]水平，以蛋白质印迹法检测MEK/ERK通路蛋白的表达水平。结果对照组、模型组和低、中、高剂量实验组心肌组织cTnⅠ水平分别为(10.50±1.08)、(42.26±4.30)、(31.85±2.44)、(23.31±2.15)和(14.85±1.19) ng•mL-1,血清cTnⅠ水平分别为(23.79±3.46)、(63.59±5.52)、(51.02±4.27)、(42.75±3.19)和(29.20±2.11) ng•mL-1,心肌组织CK-MB水平分别为(8.52±0.90)、(17.65±1.75)、(15.62±1.27)、(13.11±1.24)和(9.85±0.87) ng•mL-1,血清CK-MB水平分别为(11.32±0.98)、(21.24±1.45)、(18.75±1.32)、(15.11±1.02)和(12.27±1.11) ng•mL-1,磷酸化MEK蛋白相对表达水平分别为0.24±0.03、0.85±0.09、0.72±0.06、0.57±0.07和0.35±0.04,磷酸化ERK1/2蛋白相对表达水平分别为0.18±0.02、0.66±0.07、0.52±0.06、0.40±0.07和0.24±0.05。对照组的上述指标与模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组的上述指标与低、中、高剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论维生素D可能通过抑制MEK/ERK通路激活，进而减轻妊娠糖尿病大鼠心肌损伤。

关键词：
丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶通路
妊娠糖尿病
心肌组织
心肌酶
炎性反应
维生素D
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妊娠糖尿病是女性所特有的一种妊娠疾病，患者在妊娠期间出现胰岛素增加，造成胰岛素β细胞功能异常，可直接或间接影响胰岛素抵抗；目前有研究表明，妊娠糖尿病体内炎性因子异常表达，可增加患者发生心肌梗死、冠心病风险性[1]。研究显示，维生素D对妊娠期高血压大鼠有肝保护作用[2]。丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activates protein kinase, MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路是经典通路，其可介导妊娠期糖尿病的发生发展[3]。本研究旨在探讨维生素D介导MEK/ERK通路对妊娠糖尿病大鼠心肌损伤的影响。

1、材料与方法

1材料

动物SD雌性SPF级大鼠，鼠龄6～8周，体质量(220±20) g,购自齐鲁制药有限公司。动物使用许可证号：SYXK(鲁)-2021-0011。本研究经济南市第四人民医院伦理委员会批准(伦理批号：LL-20230007)。

药品与试剂链脲佐菌素，纯度：99%,批号：230208,购自德国Merck公司；1,25-二羟维生素D,纯度：>99%,批号：230110,购自湖北扬信医药公司。胰岛素试剂盒，购自深圳海思安生物公司；肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)试剂盒，购自上海化邦生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes, CK-MB)试剂盒、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒、C反应蛋白(C reactive protein, CRP)试剂盒，均购自上海继和生物公司；磷酸化(phosphorylated, p-)MEK抗体、MEK抗体、p-ERK1/2抗体、ERK1/2抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体，均购自英国Abcam公司。

仪器Prospect小动物超声成像系统，购自日本S-Sharp公司；16道生理记录仪，购自澳大利亚AD Instruments公司；Accu-Chek Performa血糖仪，购自罗氏卓越金采公司。

2实验方法

2.1模型构建、动物分组与给药方法

妊娠糖尿病大鼠模型建立参考文献[4]的方法进行，选择空腹血糖浓度≤7.0 mmol·L-1雌性大鼠，按照2∶1与雄性大鼠合笼。24 h后进行阴道涂片观察精子是否着床，选出40只着床成功大鼠进行实验，妊娠第1、5天以35 mg·kg-1腹腔注射2%链脲佐菌素，3 d后检测空腹血糖浓度，若空腹血糖浓度≥13.5 mmol·L-1视为模型构建成功。

将建模成功大鼠分为模型组和低、中、高剂量实验组，并选择10只雌性大鼠作为对照组。对照组、模型组均灌胃等量0.9%NaCl,低、中、高剂量实验组分别灌胃给予0.05、0.10和0.15μg·kg-1的维生素D,每天1次，连续灌胃2周。

2.2空腹血糖及胰岛素检测[5]5]

在药物干预前(造模成功时)和干预后1、2周，取各组大鼠空腹尾静脉血，用血糖仪检测空腹血糖浓度，以酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测胰岛素水平。

2.3心功能检测[3]3]

末次给药后，用超声心动图检测大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF),用多通道生理记录仪检测左心室内压最大上升速度(+dp/dtmax)和最大下降速度(-dp/dtmax)。

2.4心肌酶指标和炎性因子检测[6]6]

末次给药24 h后，麻醉处死大鼠，收集大鼠血液和心肌组织，在4℃下，以3 000 r·min-1离心10 min,收集上清液，以ELISA法检测各组大鼠血清和心肌组织cTnⅠ、CK-MB、TNF-α、CRP水平。

2.5蛋白质印迹法检测MEK/ERK通路蛋白的表达水平[7]7]

将大鼠心肌组织制备成匀浆液，提取总蛋白后测定其浓度，凝胶电泳分离上样蛋白，迅速转膜、封闭2 h,加一抗p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2及内惨GAPDH过夜孵育，次日用二抗37℃孵育1 h,加显色试剂用于显影、定影。用Image J软件对蛋白条带进行分析。

3统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用单因素方差分析，用LSD-t检验比较。

2、结果

1各组大鼠空腹血糖浓度的比较

造模成功后，低、中、高剂量实验组分别灌胃给予0.05、0.10、0.15μg·kg-1的维生素D,对照组、模型组均灌胃等量0.9%NaCl。

干预前，与对照组比较，模型组和低、中、高剂量实验组的空腹血糖浓度均显著升高(均P<0.05);但模型组的空腹血糖浓度与低、中、高剂量实验组比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较，干预后1周、2周模型组空腹血糖浓度均显著升高；与模型组相比，干预后1周、2周低、中、高剂量实验组的空腹血糖浓度均显著降低(均P<0.05);低、中、高剂量实验组组间比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

2各组大鼠胰岛素水平的比较

与对照组比较，干预前模型组及低、中、高剂量实验组的空腹胰岛素水平均显著降低(均P<0.05)。与对照组比较，干预后1、2周模型组的空腹胰岛素水平均显著降低；与模型组相比，干预后1、2周低、中、高剂量实验组的空腹胰岛素水平均显著升高(均P<0.05);低、中、高剂量实验组间比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

3各组大鼠心功能的比较

与对照组相比，模型组的LVEF、+dp/dtmax均显著降低，-dp/dtmax显著增加(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组的LVEF、+dp/dtmax均显著增加，-dp/dtmax均显著降低(均P<0.05);低、中、高剂量实验组间各指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3。

表1各组大鼠空腹血糖浓度的比较

4各组大鼠心肌组织和血清cTnⅠ、CK-MB水平的比较

与对照组相比，模型组心肌组织和血清cTnⅠ、CK-MB水平均显著增加(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组心肌组织和血清cTnⅠ、CK-MB水平均显著降低(均P<0.05);低、中、高剂量实验组间各指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表4。

5各组大鼠心肌组织和血清TNF-α、CRP水平的比较

与对照组相比，模型组心肌组织和血清TNF-α、CRP水平均显著增加(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组心肌组织和血清TNF-α、CRP水平均显著降低(均P<0.05);低、中、高剂量实验组间各指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表4。

表2各组大鼠空腹胰岛素水平的比较

6各组大鼠心肌组织MEK/ERK通路相关蛋白表达水平的比较

模型组p-MEK、p-ERK1/2蛋白相对表达水平均较对照组显著增加(均P<0.05);与模型组相比，低、中、高剂量实验组p-MEK、p-ERK1/2蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05);低、中、高剂量实验组间p-MEK、p-ERK1/2蛋白相对表达水平比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表5和图1。

表3各组大鼠心功能的比较

表4各组大鼠心肌组织和血清肌钙蛋白2(cTnⅠ)、肌酸激酶同Ⅰ酶(CK-MB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和C反应蛋白(CRF)水平比较

表5各组大鼠心肌组织丝裂原激活蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)通路相关蛋白表达水平的比较

图1 p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白的表达情况

3、讨论

链脲佐菌素对哺乳动物胰岛素B细胞有特异毒性，本研究利用其构建妊娠糖尿病动物模型，结果显示，在干预后1周、2周，模型组大鼠空腹血糖浓度显著高于对照组，空腹胰岛素水平显著低于对照组，表明模型构建成功。

维生素D是体内不可或缺的类固醇激素，也是一种脂溶性维生素，近年研究显示，其与血管生成、调节免疫、氧化反应、保护心肌组织等有关[8]。本研究大鼠灌胃不同浓度维生素D后发现，干预后1周、2周维生素D可降低空腹血糖浓度、提高空腹胰岛素水平，还可改善大鼠心功能LVEF、+dp/dtmax、-dp/dtmax,表明维生素D可改善妊娠糖尿病大鼠糖代谢能力、心功能。

本研究结果发现，在模型组心肌组织和血清中cTnⅠ、CK-MB、TNF-α、CRP含量均显著增多，而维生素D可减少上述因子合成释放，表明维生素D可减轻妊娠糖尿病大鼠心肌酶损伤和炎性反应。

研究显示，MEK/ERK通路激活可促进妊娠糖尿病疾病进展[9]。本研究结果发现，模型组p-MEK、p-ERK1/2蛋白表达上调，给予不同浓度维生素D后，可降低其蛋白表达水平，表明维生素D对妊娠糖尿病大鼠的调节作用可能与MEK/ERK通路有关。

参考文献:

[2]宣佳利.维生素D对妊娠期高血压大鼠肝脏的保护作用及机制[J].牡丹江医学院学报,2022,43(5):10—13.

[3]邢少宁,符爱贞,程虹,等.二甲双胍对妊娠期糖尿病大鼠MEK/ERK通路及心肌凋亡的影响[J].广西医科大学学报,2023,40(2):254—261.

[4]王湘,郭玉芳,王爽,等.葛根素对妊娠期糖尿病大鼠心肌损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2020,36(17):2643—2645.

[5]赵岗,杨丽,樊秀梅.芹菜素通过PI3K/Akt通路对妊娠期糖尿病大鼠胰岛素抵抗的作用[J].药物评价研究,2020,43(3):417—422.

[6]黄岳青,陈蕾.芒果苷对妊娠期糖尿病大鼠血清中TNF-α､IL-6和糖代谢的影响[J].贵州医药2018,42(10):1158—1161.

[7]苗珠月,魏汝恒,刘可心,等.羟基红花黄色素A对糖氧剥夺/复糖复氧诱导的BV2细胞炎性反应的机制研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(10):1412—1416.

[9]王晓岩.性激素结合球蛋白通过RAS/RAF/ERK通路对妊娠期糖尿病发病机制的影响[D].辽宁沈阳:中国医科大学,2021.

文章来源:贾二霞,徐娜,李帅,等.维生素D介导MEK/ERK通路对妊娠糖尿病大鼠心肌损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(07):1014-1018.