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高频经颅磁刺激对脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元自噬影响

2024-11-25 65 上传者：管理员

摘要：目的探究高频经颅磁刺激(rTMS)对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠海马神经元的影响。方法 36只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、rTMS组，每组12只。造大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)大鼠模型。24 h后采用Longa神经功能评分判断造模是否成功；rTMS组予以rTMS干预，术后第7天用Longa神经功能评分评估神经缺损程度。苏木素-伊红(HE)染色法观察左侧海马组织病理形态改变；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑脊液肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-1β含量；实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹分别检测缺血区脑组织P62、Beclin-1、VPS34、微管相关蛋白1轻链(LC)3B mRNA和蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组Longa神经功能评分、脑脊液IL-6、IL-1β、TNF-α含量及海马组织P62、Beclin-1、VPS34 mRNA及蛋白、LC3B mRNA和LC3B-Ⅱ/Ⅰ明显升高(均P<0.05),HE染色显示神经元排列紊乱，结构不清；与模型组比较，rTMS组以上指标明显降低(均P<0.05),HE染色显示神经元受损程度减轻。结论高频rTMS治疗可能通过抑制海马神经元自噬相关蛋白和减轻炎症反应减轻MCAO/R大鼠脑组织损伤。

关键词：
海马体
神经炎性反应
经颅磁刺激
脑缺血再灌注损伤
自噬
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缺血性脑卒中治疗的首要原则是使缺血区域血流再通，尽快恢复梗死脑组织血氧供应，但可能会引起脑缺血再灌注损伤(CIRI),对脑组织造成二次伤害[1]。自噬和炎症反应与CIRI的发生有直接关联[2],可导致微血管功能障碍进而造成周围组织的再次损伤[3]。因此如何减轻炎症反应和抑制自噬水平，从而产生神经保护作用，成为解决CIRI的重要途径。重复经颅磁刺激(rTMS)是利用脉冲磁场在脑组织诱导感应电流，通过改变刺激频率达到兴奋或抑制大脑皮质的作用[4]。研究表明，rTMS可有效促进CIRI后的神经功能恢复，其中rTMS治疗CIRI的经典机制是调节神经炎症，但有研究表明自噬对炎症反应的抑制有保护作用，并且保护作用与CIRI的阶段和自噬反应水平有关[5]。本实验通过建立大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)大鼠模型，旨在探讨高频rTMS对MCAO/R大鼠海马神经元神经炎性反应和自噬相关蛋白的影响，为rTMS治疗CIRI提供理论基础。

1、材料与方法

1.1实验动物

36只250～300 g清洁级雄性SD大鼠购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(湘)2022-0011。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、rTMS组，每组12只。饲养于南华大学实验动物中心，室温(24±2)℃,湿度(50±5)%,12 h黑暗/光照循环交替，饮水及饲料充足。

1.2主要仪器及试剂

尼龙线栓(广州佳灵生物技术有限公司),实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)仪、荧光PCR板(美国Thermo),摇床、旋涡混合器(江苏其林贝尔有限公司),台式冰冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司),电泳仪、电泳槽、转膜仪(北京六一生物科技有限公司),经颅磁刺激仪(武汉依瑞德医疗设备有限公司)。白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉华美生物工程有限公司),P62(货号：18420-1-AP)、Beclin-1(货号：ab62557)、VPS34(货号：12452-1-AP)一抗(美国proteintech公司),微管相关蛋白1轻链(LC)3B(货号：#12741)一抗(英国Abcam公司)。

1.3造模方法

参照改良的Longa线栓法[6],模型组及rTMS组接受左侧脑缺血再灌注模型造模。先使用1%戊巴比妥钠，以40 mg/kg的剂量注射入大鼠腹腔进行麻醉。麻醉后，将大鼠仰卧固定于实验板，把大鼠颈部皮肤毛发剔除后使用碘伏消毒。沿颈部正中偏左0.5 cm切开皮肤，沿颈前三角下，钝性分离筋膜及肌肉组织，充分暴露并游离左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。再用3-0手术线将颈总动脉和颈外动脉近心端永久结扎，并在颈总动脉分叉口下放一手术线并打活结，再用4.7 cm微动脉夹暂时夹闭颈内动脉，在活结下4 mm,使用显微剪倾斜45°剪一小口，再插入0.40 mm的尼龙线栓，沿颈内动脉向颅内方向插入，遇到阻力并且线栓黑色标记到达分叉口处，将分叉口处活结永久结扎，栓塞2 h后拔出线栓。假手术组仅暴露并游离颈动脉。

1.4干预方法

rTMS组于建模成功24 h后接受rTMS干预，将动物专用线圈连接rTMS主机，线圈中心贴紧大鼠前囟左侧旁开0.5 cm,随后用大鼠固定器将大鼠固定，确保其头部的位置保持不动，刺激参数为频率10 Hz,刺激强度为最大输出强度的30%,总脉冲数为1 800,每天一次，连续7 d,假手术组和模型组给予伪rTMS刺激。

1.5观察指标与检测方法

(1)神经功能评定：造模后第2天进行评分，将≥2分的大鼠随机分到模型组和rTMS组。干预后第7天，采用Longa神经功能评分对各组进行神经功能受损程度的评定，评分越高则神经损伤程度越高。(2)苏木素-伊红(HE)染色观察海马体形态：将多聚甲醛固定的海马体脱水包埋，切片，先后用苏木素和伊红染液，再置于二甲苯10 min,显微镜观察。(3)ELISA检测脑脊液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量：取脑脊液，离心，取上清，温育。再加生物素标记抗体工作液，再温育。洗板，加过氧化物酶标记亲和素，温育。弃液、甩干、洗板，加底物溶液，避光显色，加终止液终止反应。最后用酶标仪测量各孔的吸光度值。(4) RT-PCR法检测缺血区海马组织中mRNA表达：保存的组织中加入1 ml Trizol研磨、裂解、离心、沉淀及紫外分光光度计测定浓度，以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA,以cDNA为模板进行扩增，β-actin为内参。引物由上海生工合成，后采用SYBR法完成RT-PCR实验。引物序列：β-actin上游5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′、下游5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3′;P62上游5′-GCTCGACCCGTCCTTCACTCA-3′、下游5′-CAGGGATCAGTACCCGCTCT-3′;Beclin-1上游5′-GTGGCGGCTCCTATTCCATC-3′、下游5′-GACACCCAAGCAAGACCCCA-3′;VPS34上游5′-ACCGGCACCTGGATAACCTT-3′、下游5′-GTA-CCACCCATCCCTTCGACCA-3′;LC3B上游5′-AACACAGCCACCTCTCGACCT-3′、下游5′-ACACAACCCACACACGGCAG-3′。(5)Western印迹法检测缺血区海马组织中蛋白表达：剪取0.025 g组织，用冰预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗组织，加入RIPA裂解液于冰上裂解，4℃,12 000 r/min离心15 min后取上清，测定蛋白含量，加热使其变性，再经电泳、转膜、封闭，与P62、Beclin-1、VPS34、LC3B一抗孵育，1×磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗后孵育。电化学发光(ECL)显色曝光，使用ECL液与膜孵育，显影冲洗。

1.6统计学分析

采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析及LSD-t检验。

2、结果

2.1各组神经功能评分比较

模型组Longa神经功能评分明显高于假手术组，rTMS组Longa神经功能评分明显低于模型组(均P<0.05)。见表1。

2.2各组脑脊液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

相较于假手术组，模型组脑脊液炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显增高(P<0.05)。相较于模型组，rTMS组脑脊液炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3各组海马体HE染色

假手术组海马体神经元排列较整齐，胞质丰富且淡染。模型组海马体神经元排列紊乱，结构不清，正常神经细胞数目减少。rTMS组较模型组海马体神经元排列较为整齐，数目较多。见图1。

2.4各组缺血区海马组织中P62、Beclin-1、VPS34、LC3B mRNA及蛋白表达比较

模型组缺血区海马组织中P62、Beclin-1、VPS34 mRNA及蛋白、LC3B mRNA、LC3BⅡ/Ⅰ表达较假手术组明显增高(P<0.05);rTMS组缺血区海马组织中以上指标较模型组明显降低(P<0.05)。见表2、图2。

表1各组Longa神经功能评分及脑脊液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

图1各组海马组织神经元(HE染色，×400)

表2各组缺血区海马组织中P62、Beclin-1、VPS34、LC3B mRNA及蛋白表达

图2 Western印迹检测各组自噬相关蛋白表达

3、讨论

缺血性脑卒中后脑组织血流再灌注会导致神经元损伤，但再灌注仍是治疗的首要原则，因此如何减轻CIRI至关重要[7]。rTMS作为一种新型的无创性中枢神经调控技术已经被广泛应用于脑卒中后运动功能障碍、吞咽功能障碍和认知功能障碍等，并取得了良好的疗效[8],研究表明，rTMS可通过抗炎、抗氧化应激、调节自噬等多种途径来改善神经疾病[9]。本研究验证了高频rTMS对MCAO/R大鼠发挥神经细胞保护作用。

级联炎症反应是CIRI的重要病理环节，大量的炎症介质及炎症细胞参与CIRI过程。CIRI后大量免疫细胞进入大脑，从而激活神经胶质细胞分泌促炎细胞因子，参与脑组织损伤的发展[10,11]。研究表明，rTMS可促进小胶质细胞的极化状态从M1转变为M2表型，减少小胶质细胞过度活化，从而减轻炎症反应，保护神经元[12]。M1极化小胶质细胞是促炎细胞因子的部分来源，其产生的TNF-α、IL-1β和IL-6诱发的炎症反应加重了脑缺血再灌注后的神经损伤[13]。M2极化小胶质细胞释放抗炎细胞因子，参与组织修复从而减轻炎症反应，发挥神经保护作用[14]。本研究结果提示，高频rTMS在CIRI后具有抗炎作用。

适当的自噬水平是维持细胞内环境稳态的重要机制，而细胞内环境的稳定对神经元正常的功能和生存至关重要[15]。CIRI发生后，自噬蛋白和自噬小体在海马区积聚，自噬水平开始升高，并持续上升至少1 w[16]。VPS34负责延伸自噬泡膜和招募ATG蛋白朝向自噬泡，Beclin-1可与VPS34结合形成自噬相关基因(Atg)1/UNC-51样自噬激活激酶(ULK)1复合物[17],发生CIRI后，Beclin-1与VPS34形成的该复合物可抑制磷脂酸激醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的活性，从而抑制哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)的活性，激活自噬[18]。LC3是哺乳动物中Atg8的同源物[19]。在自噬过程中，前体LC3C端的氨基酸蛋白质被降解，形成LC3Ⅰ,LC3Ⅰ与磷脂酰丝氨酸耦联形成LC3Ⅱ,是形成自噬小体的可靠蛋白质标记物，LC3Ⅱ/Ⅰ水平可估计自噬水平的高低[20],模型组LC3Ⅱ蛋白表达水平升高，经高频rTMS干预后蛋白水平下调，可能是抑制自噬水平从而发挥神经细胞保护作用。P62是自噬特异性的底物蛋白，可被LC3招募到自噬系统中被降解，因此，P62水平升高通常被认为是自噬活性受阻的标志[21]。本研究提示，高频rTMS可能通过抑制自噬水平改善大鼠缺血再灌注后的神经损伤。然而，高频rTMS在CIRI后调节自噬的具体细节尚不清楚，有待深入研究；本研究中只采用了高频rTMS进行干预，后续可从不同刺激参数进行比较。

综上，高频rTMS可有效改善MCAO/R大鼠海马组织的神经损伤，提高神经功能，这可能是通过抑制CIRI后炎症反应及自噬相关蛋白来实现的。

参考文献:

9刘佳琳,王帅,张立新.经颅磁刺激促进脑卒中功能恢复的作用机制[J].中国医学物理学杂志,2021;38(10):1279-84.

基金资助:国家自然科学基金(82002400);湖南省自然科学基金(2023JJ40589);湖南省研究生创新课题(CX20221001);南华大学附属第一医院4310计划(20214310NHYCG07);南华大学研究生科研创新项目(223YXC025);

文章来源:贾飞阳,周君,刘丹妮,等.高频经颅磁刺激对脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经元自噬的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(22):5502-5506.