脊髓性肌萎缩症（SMA）为常染色体隐性遗传病，是由位于5号染色体5q13.2上的运动神经元存活基因1(SMN1）突变导致SMN蛋白功能缺陷所引起的遗传性神经肌肉病[1,2,3]。临床上，SMA以脊髓前角运动神经元退化变性和丢失导致的肌无力和肌萎缩为主要特征，发病率为1/10000～1/6000，携带者频率为1/50～1/40[4]。分子层面，SMA是由5号染色体上SMN基因座的变异引起的，该染色体通常包含两个几乎相同的编码运动神经元基因产物存活的基因拷贝—SMN1和SMN2，二者存在部分特定的单核苷酸差异[5,6]。SMN1基因的突变主要包括7号和/或8号外显子缺失（95%以上）以及点突变等类型，但SMN基因突变如何导致运动神经元特异性疾病的致病机制尚不明确[4,7]。SMN2的拷贝数多少与疾病的严重程度密切相关，也是值得研究的目的基因。

由于SMA临床表现严重，人群携带率高，且药物治疗昂贵，对备孕及孕期女性进行SMA检测有助于有效识别携带者，实现疾病阻断，减少新发病例[8,9]。2018年5月，SMA被列入国家卫健委等五部委联合制定的《第一批罕见病目录》[10]。

较常见的SMA检测方法包括限制性片段长度的多态性分析（PCR-RFLP)[11]、多重连接探针扩增技术（MLPA)[12]、Taqman探针荧光定量PCR[13]、测序如Sanger测序法或二代测序[14]，其中定量PCR(qPCR）具有准确性高、稳定性好、大通量以及配套设施成熟等特点，是SMA诊断的主要辅助手段。本文围绕用于SMA检测的qPCR产品扩增体系的各个质量控制点设置进行讨论，以指导相关生产企业的研发和注册人员进行合理的产品设计开发及注册申报。

1、检测方法

1.1PCR-RFLP

该方法的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该方法存在酶切不彻底，不能区分携带者与正常人，且开盖过程较多易导致实验室PCR产物污染的缺点，多用于科研实验室，未见用于临床诊断。

1.2MLPA

该技术于2002年由SCHOUTEN等[15]首先报道，是一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的技术。MLPA通过一系列探针与目的基因特异区域核酸杂交、连接酶将探针连接、以特异性连接探针为模板进行基因扩增、毛细管电泳定性和定量分析扩增产物，对目的基因的拷贝数进行相对定量分析。MLPA技术能明确区分患者、携带者及正常人，但该方法操作繁琐，需要一代测序仪，设备成本高。

1.3Taqman探针荧光定量PCR

使用标记有荧光基团和淬灭基团的Taqman探针，对目的基因进行扩增检测，部分方法采用1个人基因组内参和目的基因组成双重检测体系，从而实现目的基因的相对定量。该方法操作简便，性能稳定，检测通量大，设备普及度高，且探针特异性高，不易出现误判。

1.4二代测序

该方法的主要原理是通过统计SMN1和SMN2的总拷贝数，再根据c.840C>T分析SMN1reads与SMN2reads比例，最后得出每个人分别携带几拷贝的SMN1和SMN2[16]。但由于SMN1与SMN2基因的高度相似性，需对目的基因进行深度测序，导致检测成本相对较高。

2、SMA核酸检测试剂注册申报的基本要求

在我国，体外诊断（IVD）试剂根据风险程度高低依次分为第三类、第二类和第一类产品，核酸检测相关的IVD试剂作为第三类医疗器械进行管理，属于高风险产品，可能造成严重的个人及社会危害，需进行严格的注册技术评价才能获得上市许可。上市前技术评价关注点既包括对临床预期用途、分析性能、第三方验证的要求，也包括对主要原材料、生产工艺及反应体系的综合评估[17]。前者主要是实验室和临床应用的性能验证，可细分为：产品采用的技术原理描述及评价原则、对主要分析性能（如精密度、准确度、灵敏度、特异性、线性范围等）的设计及验证、阳性判断值或参考区间的确定依据、第三方技术评价的要求、临床适应症相关的临床评价（临床试验）要求等；后者则主要是对生产质量管理体系的要素验证，包括主要原材料选择依据及评价资料、生产工艺及反应体系的确认及评价要求、半成品检定及生产制造有关操作规程及信息文件。通过以上各项研究资料上市前技术评估，保证上市医疗器械产品的持续安全有效，质量可控。

3、荧光定量PCR法对SMA检测体系和质控体系的基本要求

SMA的分子研究表明，96%以上是由于SMN1基因7号和/或8号外显子缺失所致[7],qPCR试剂设置为针对第7和/或8号外显子进行检测即可覆盖几乎所有针对SMN1基因7号和/或8号外显子缺失所致的携带人群，因此本文重点围绕此类基因靶点设置的PCR试剂展开讨论，不涉及其他小概率基因突变的情况。

3.1样本采集

由于DNA样本相对易于提取和保存，因此样本采集主要考虑样本的易得性，如是普通人检测，可使用口腔拭子等取材方便的方法，如在其他检测中已留存有血液、羊水等，可直接使用该样本进行DNA提取。此外还有血片、其他组织等样本采集方式。无论何种样本，均必须注意采集后的保存和运输条件，建议冷藏保存和运输。长时间保存可提取样本DNA后保存或-70℃以下深冷冻。另外，以肝素作为抗凝剂的样本，提取的DNA可能会抑制PCR实验，因此应尽量避免使用。

3.2核酸提取纯化

核酸提取纯化是进行核酸扩增反应的前提，其质量和纯度也是决定qPCR成败的关键。核酸提取目的是释放核酸，并尽量保证完整性，去除多余杂质、污染物、药物残留及其他干扰物质，以保证qPCR过程不受干扰，从而得到准确的结果。目前主流的核酸提取方法有磁珠法和硅膜法，提取步骤主要包括裂解细胞膜、消化蛋白质、释放核酸、结合核酸分子、去除杂质、洗脱纯化核酸等流程。磁珠法提取方式在密闭空间进行，当某些样本靶基因载量过高时，自动提取的振动、混匀、移液等过程中可能会产生气溶胶，从而导致样本交叉污染，使用前需进行严格的验证或确认。

核酸提取试剂可选用经注册备案的商业化试剂，亦可是配套使用、作为关键组分与扩增试剂同时进行注册。

3.3引物和探针

在设计方面需考虑以下几点：(1)SMN2会对SMN1的检测结果造成干扰，在进行引物探针设计时，须注意充分考虑SMN1基因的特点设计引物或探针，选择保守序列，如第7号外显子与第8号外显子SMN1与SMN2存在差异的地方；(2)设计时需考虑反应管内的荧光设置量值，相互间的干扰平衡，要避免引物探针发卡结构、二聚体、异二聚体及引物错配带来的非特异性扩增；(3)需多对引物探针时，应注意引物之间Tm值差异不超过2℃，建议设于58～62℃之间，扩增产物大小设于50～150bp之间；(4)探针Tm值建议在67～70℃之间，高于引物Tm值7～10℃，以使退火时探针能够优先与模板结合，提高探针的杂交效率；(5)探针的淬灭基团最好使用MGB探针，可提高8～10℃的Tm值，使探针的碱基长度相对变短，在不损失结合效率的情况下提高特异性。不推荐使用自身带有荧光的淬灭基团，如TAMRA，会增加本底信号，降低检测灵敏度。

合成及纯化方面可参考GB/T34797-2017来设置对于核酸扩增用引物探针的技术要求[18]，建议采用以下步骤来获得稳定的引物探针：(1)选择市场上口碑较好的多家合成公司，采购一定量的测试装引物探针；(2)尽量选择PAGE或HPLC进行纯化，纯度不低于95%，并出具出厂质量报告；(3)对采购的所有测试装进行横向对比验证，选择性能优异的供应商1～2家，并根据验证结果制定合适的质控标准，包括对浓度、纯度、荧光素、性能验证、样本验证等质控要求；(4)再次向选定的供应商分时间段采购2～3批试用装，并再次根据上述质控标准进行纵向及横向对比，确定最终供应商及质控标准。引物和探针合成过程中可能出现序列不准确、碱基缺失、脱嘌呤产物等问题，不经过纯化可能会造成扩增效率低、引物探针使用量大、非特异性信号、荧光强度弱等异常，因此，用于qPCR反应的引物探针必须经过纯化步骤。

3.4主要反应物及辅助剂

qPCR扩增体系主要由DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、缓冲液、引物探针、模板及必要的辅助剂等组成，以下分别详述有关质控要求。

3.4.1DNA聚合酶

qPCR主要是利用DNA聚合酶的外切酶活性来水解结合在DNA模板上的荧光探针，释放荧光基团产生信号累积，由PCR仪收集游离的荧光信号，转化为数字信号，随着PCR反应的进行，收集的信号会逐渐增强，从而形成实时信号。关于DNA聚合酶有4方面因素需要考虑：(1)酶活性对于扩增效率影响较大，活性弱，则收集的荧光信号就弱，导致CT值变大，反应灵敏度降低；(2)保真度，如PCR扩增过程中的碱基错配发生在引物和探针结合区时，会降低结合效率，并可能导致错误的扩增序列；(3)热启动特性，可保证当温度达到90℃时再释放DNA聚合酶的活性，以减少延伸错配的发生；(4)热稳定性，qPCR推荐的循环数一般在40个循环以上，良好的热稳定可保证在反复交替的高低温循环中保持较高的扩增活性。

3.4.2尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase,UNG)

经过几十轮的PCR扩增循环后，反应管内产生了数以百万计的目标片段产物，如形成气溶胶，将污染整个实验室，导致假阳性出现，除必要的管外环境控制外，使用UNG酶是防止交叉污染的重要管内因素。UNG酶可选择性水解断裂含dUTP的DNA双链，在随后的变性条件下，该DNA发生断裂，不能够为PCR模板进行扩增，从而保证扩增结果的特异性，同时，UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的含dUTP的PCR产物。普遍情况下，不同的聚合酶对添加入体系中的dUTP合成PCR产物的能力存在差别，可能会存在合成效率的差别。进行含UNG酶体系研究时，可用dUTP部分或全部替代dTTP，并对不同供应商来源的UNG酶性能进行验证，调整选择最优的酶浓度和dNTP、dUTP浓度，保证合成效率。

3.4.3引物浓度

在保证引物质量的前提下，引物的浓度与扩增效率密切相关，研究过程需找到最适的引物浓度，而非浓度越高越好。当SMN1基因的检测设置为多重PCR时，还需考虑不同引物对酶和其他底物的竞争，此时更需对引物浓度进行系统研究。常规情况下，多重反应的扩增效率和灵敏度均低于单独反应，但此类反应用于基因组DNA的检测，对特异性的要求相对更高一些。

3.4.4PCR辅助剂

研究表明，二甲基亚砜（DMSO）、环丁砜、甲酰胺等可增强PCR反应的效率和特异性。这些化学物质有助于减少二级结构、打开DNA双链结构、增加DNA聚合酶的稳定性，可增强高GC含量序列的扩增效率以及引物与模板的结合效率，从而提高灵敏度。但辅助剂的应用必须进行必要的验证，不同的辅助剂适用不同的PCR体系，必须根据验证的实际情况选择最佳辅助剂，并确定最适添加浓度。

此外，镁离子浓度、dNTP浓度、缓冲液无机盐离子以及模板的质量等均会对PCR的扩增效率造成一定的影响，PCR体系的选择和确认是系统、动态的。对于SMA基因的检测，生产企业研究人员可在经验积累的基础上，充分借鉴市场上较成熟的PCR体系，并不断优化调整，找到最适配置。

3.5质控设置

采用qPCR方法进行SMA相关基因检测需设置合理的质控品同步进行反应，以解决检测过程中出现的假阴性或假阳性问题，质控体系通常包括内部质控和外部质控两部分。

3.5.1内部质控

选择管家基因作为内参，并针对性地设计引物和探针，与目的基因检测用引物探针混合成引物组，正常人的基因组DNA梯度稀释后使用引物组进行检测，对两组或多组引物组的扩增效率进行对比，选择扩增效率接近的引物探针组。当扩增体系稳定的情况下，如内控出现扩增异常，则说明模板存在质量问题；如内参扩增正常，而目的基因检测异常，则说明目的基因存在拷贝数的变异。

3.5.2外部质控

进行SMA基因检测时，外部阳性质控可设置为单点质控品，仅对阴阳性进行判断，亦可设置为多点线性参考品，常用5点浓度来绘制标准曲线，从而对一定范围内的线性相关性进行判断。使用目的基因缺失基因组样本作为阴性对照，可监控实验室、试剂、耗材的交叉污染。以下两点需要注意：(1)尽量选择与待检样本基质类似的参考品，且必须进行严格的等效性验证；(2)如为线性参考品，则浓度跨度稍小为宜，结果会更可靠。

3.6PCR反应体积和反应程序研究

PCR扩增体系的体积与检测结果稳定性存在一定的相关性，常规推荐20～50μL的反应体系，可使用不同浓度样本多次重复实验，对其稳定性进行综合评估后，根据实际需求选择最适的反应体系和加样量，SMA用于检测人体基因组DNA，加样量和反应体积可适当偏小。检测SMA的PCR反应程序关键参数设置如下：(1)变性温度和时间，对于基因组DNA来说，94～98℃的变性温度即可满足要求；(2)退火温度，主要考虑引物合成情况，可采用56～62℃之间的多个温度梯度进行选择研究；(3)退火时间，建议选择15、30、45s进行选择研究。

3.7适用机型

适用机型是确定整体设计必须考虑的重要因素之一，每个PCR分析仪生产厂家对其仪器适配的检测试剂各质控要素均有一定偏好。机型选择应考虑以下几点：(1)根据多重荧光素选择适用机型，SMA检测常涉及多重检测，荧光通道应适当增加；(2)选择分辨率高的设备；(3)PCR分析仪的升降温速率反映仪器性能，相同扩增体系时，尽量选择运行时间更短的设备；(4)通过变异度分析，尽量选择精密度较稳定的设备。

4、小结

SMA是一种较常见的导致儿童早期死亡的遗传缺陷病，在致死性常染色体隐性遗传病中列第二位。超过80%的重症患儿在4岁前死亡，大部分患者生存期难以超过成年[19]。

中共中央、国务院于2016年印发的《“健康中国2030”规划纲要》提出了健康中国的建设目标和任务。习近平总书记在党十九大报告中明确强调实施健康中国战略，并做出重大决策部署，强调坚持预防为主，控制重大疾病的发生率，至2022和2030年，婴幼儿死亡率分别控制在7.5‰及以下和5‰及以下[20,21]。对于SMA，由于市售专用药品疗效欠佳，且价格高昂，实施充分的SMA携带者孕前/产前检测是降低患儿出生率的重要手段。qPCR是目前我国用于SMA携带者检测的主要手段，qPCR的整体实验设计需要考虑的质控点很多，待扩增靶位点识别、原料选择、扩增体系优化、质控参考品构建以及适用机型评价等均是实验成功的关键。随着科学技术的发展以及先进技术在临床诊断方面的应用，不久的将来，qPCR技术将向数字化、自动化、信息化以及全封闭的方向发展，qPCR实验的质控点也会随之进行调整。医疗器械注册技术审评环节对拟上市医疗器械进行安全有效性及质量可控性的综合评价[22]，对产品设计开发的各质控点进行全面评估及确认，并出具是否同意注册批准的技术评估意见。在注册申报之前，生产企业研发及注册人员需及时关注并熟练掌握技术审评部门对特定医疗器械的技术评价要求，并合理准备注册申报资料，以利于合规产品的快速获批上市，尽早服务于疾病诊治和人民健康。

参考文献：

[4]国家卫生健康委罕见病诊疗与保障专家委员会办公室.罕见病诊疗指南(2019年版)[EB/OL].(2019-02-27)[2019-12-30].

[17]国家药品监督管理局.体外诊断试剂注册管理办法.[EB/OL].(2014-07-30)[2019-12-30].

[18]全国生化检测标准化技术委员会.GB/T34797-2017核酸引物探针质量技术要求[S].2017-11-01.

[20]中国共产党中央委员会,中华人民共和国国务院.“健康中国2030”规划纲要[J].中国实用乡村医生杂志,2016,24(7):1-12.

[21]共产党员网.习近平:决胜全面建成小康社会夺取新时代中国特色社会主义伟大胜利———在中国共产党第十九次全国代表大会上的报告[EB/OL].(2017-10-18)[2019-12-30].

[22]国家药品监督管理局.医疗器械注册管理办法[EB/OL].(2014-07-30)[2019-12-30].

李耀华.qPCR法检测脊髓性肌萎缩症基因的质控点初探[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):714-718.