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高协同纳米递药系统对淀粉样前体蛋白/早老素1)转基因小鼠认知功能的影响

2020-09-09 328 上传者：管理员

摘要：目的：探讨高协同纳米递药系统对淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠认知功能的影响。方法：选取雄性阿尔茨海默病(AD)APP/PS1转基因小鼠100只为实验组,并随机分为氯碘羟喹组22只、多奈哌齐组22只、空颗粒组21只、联合给药组25只、AD模型组10只,前4组采用高协同纳米递药系统经鼻分别给予氯碘羟喹、多奈哌齐、空纳米颗粒、多奈哌齐联合氯碘羟喹,AD模型组无任何干预措施;另选取同月龄C57野生型小鼠20只为对照组。检测β淀粉样蛋白(Aβ)和乙酰胆碱酯酶(AchE)表达。结果：Morris水迷宫定位航行实验结果显示,实验组给药前第1～5天逃避潜伏期明显长于对照组(P<0.05,P<0.01);空间探索实验结果显示,实验组目标象限游泳时间明显低于对照组[(18.0±8.0)%vs(22.0±12.0)%,P<0.05]。与AD模型组比较,联合给药组第1、2、4、5天逃避潜伏期明显缩短,联合给药组、多奈哌齐组和氯碘羟喹组目标象限游泳时间明显升高(P<0.05,P<0.01)。联合给药组额区和颞区θ频带明显低于AD模型组,α+β频带明显高于AD模型组(P<0.05,P<0.01)。免疫组织化学染色显示,联合给药组海马Aβ沉积最少,其次为氯碘羟喹组,均较AD模型组减少。联合给药组海马AchE和Aβ表达低于其他4组。结论：高协同纳米递药系统经鼻联合给予多奈哌齐、氯碘羟喹均能一定程度改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力、相应组织状态。该系统可能成为治疗AD的新型给药方式。

关键词：
投药
淀粉样β肽类
纳米技术
阿尔茨海默病
鼻内
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阿尔茨海默病(AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,其发病机制尚无定论,目前较被认可的机制主要为胆碱能神经元假说及β淀粉样蛋白(Aβ)毒性假说[1]。锌离子的动态平衡与AD的发病密切相关,其作为一种内源性的神经递质,参与调节神经系统中兴奋性和抑制性神经递质的突触传递[2]。且锌离子含量随脑内Aβ水平增加而增高。因此,调节脑内锌离子的代谢稳态已成为AD治疗的重要方法之一。

由于血脑屏障的存在,采用常规口服和静脉给药方式药物不能有效作用于脑内靶点[3,4]。与之相比,鼻腔给药可经嗅区黏膜吸收直接将药物转运入脑脊液和脑组织,从而提高药物的生物利用率,对于脑靶向药物治疗具有显著优势[5]。

天津大学生命与科学技术学院自主研发了纳米递药系统治疗淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)转基因小鼠。该系统采用人血清白蛋白为载体,通过包覆乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂、锌离子螯合剂2种治疗药物,并采用跨膜肽、神经节苷脂对其进行多功能修饰,同时具备跨黏膜、靶向Aβ、抗Aβ聚集、抑制AchE多种协同治疗作用。本研究通过对比高协同纳米递药系统经鼻给药前后APP/PS1小鼠行为学、神经电生理、病理等多项指标,探讨高协同纳米递药系统的临床疗效,以期为改善AD的临床治疗效果提供实验依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

健康雄性ADAPP/PS1转基因小鼠100只,6月龄,购自山东斯科贝斯生物科技股份有限公司。健康雄性C57小鼠20只,6月龄,购自北京华阜康生物科技有限公司。实验动物均分笼饲养于25℃恒温环境中,进行自由饮食。

1.2实验分组与方法

ADAPP/PS1转基因小鼠100只为实验组,并随机分为联合给药组25只、氯碘羟喹(锌离子螯合剂)组22只、多奈哌齐(胆碱酯酶抑制剂)组22只、空颗粒组21只、AD模型组10只(无任何干预措施)。C57野生型小鼠20只为对照组。因纳米递药系统的载体为人血清白蛋白,其制备后4℃冷藏及反复多次吸取过程中易被污染、变质,致使其入脑后成为致痫因素引发较强烈抽搐致实验小鼠死亡,后期实验过程中缩短药物制备周期,规避上述问题。实验组最终42只合格小鼠纳入实验统计分析,联合给药组8只、氯碘羟喹组8只、多奈哌齐组8只、空颗粒组8只、AD模型组10只。

高协同纳米递药系统经鼻给药30d,1次/d。给药前均用异氟烷麻醉,待小鼠呼吸均匀后,经鼻给药。联合给药组采用戊二醛交联法制备包载多奈哌齐、氯碘羟喹的蛋白纳米颗粒,经鼻给药30μl/次;氯碘羟喹组和多奈哌齐组采用戊二醛交联法分别制备包载氯碘羟喹和多奈哌齐的蛋白纳米颗粒,经鼻给药30μl/次;空颗粒组采用乙醇析出法制备空蛋白颗粒,蛋白浓度为20mg/ml,经鼻给药30μl/次。

1.3Morris水迷宫

给药前后对小鼠行Morris水迷宫行为学检测,分为定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验测量动物在水迷宫中的空间学习能力。实验历时5d,训练1次/d。通过影像跟踪系统记录小鼠寻找并爬上平台所需时间,即逃避潜伏期。空间探索实验测量动物的空间记忆能力。第6天撤除平台,从平台所对象限入水,影像跟踪系统记录60s内小鼠在目标象限游泳时间。

1.4苏木精-伊红染色

取小鼠脑组织,脱蜡,用苏木精-伊红染色观察小鼠海马CA1区的细胞形态。

1.5免疫组织化学染色

采用免疫组织化学染色观察各组小鼠海马Aβ聚集形成的老年斑数量,按照说明书操作步骤。

1.6Westernblot实验

按照说明书操作,检测各组小鼠海马组织中AchE和内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)表达,Aβ和内参Tublin表达。

1.7小鼠皮质脑电信号采集及分析

用Medilog动态脑电记录系统,金属针电极,单极导联,连续记录小鼠右侧额、颞区皮质脑电信号。小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,待呼吸均匀后将小鼠固定,充分暴露Bregma点。右额电极位点:中线右旁开0.5mm,Bregma点前1.54mm,深度0.3mm;右颞电极位点:中线右旁开1.75mm,Bregma点后2.06mm,深度1.4mm;参考电极位点:Bregma点后4mm,中线左旁开2mm。接地电极位于尾巴根部。按上述定位钻孔,插入针电极,连接脑电记录系统,记录时间为15min。挑选基线平稳、伪迹较少的3段脑电信号进行分析,采样频率为200Hz,采样精度16bit,每段采样时间5.12s。在MatlabR-2013b上,经EEGLAB滤波、去基线等预处理后,采用自编程序,分别计算各组小鼠额区、颞区的脑电总功率以及各频带(δ、θ、α+β、γ频带)功率比并进行分析比较,其中频带功率比=所计算频带功率/总功率×100%。

1.8统计学方法采用SPSS20.0统计软件,计量资料以表示,采用两独立样本t检验或单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

采用SPSS20.0统计软件,计量资料以表示,采用两独立样本t检验或单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1实验组与对照组小鼠给药前Morris水迷宫实验比较

定位航行实验结果显示,实验组给药前第1～5天逃避潜伏期明显长于对照组(P<0.05,P<0.01,表1);空间探索实验结果显示,实验组目标象限游泳时间明显低于对照组[(18.0±8.0)%vs(22.0±12.0)%,P<0.05],造模成功。

表1实验组与对照组定位航行实验逃避潜伏期比较(s,x±s)

2.2各组小鼠给药后Morris水迷宫比较

定位航行实验结果显示,与AD模型组比较,联合给药组第1、2、4、5天、多奈哌齐组第1、5天和氯碘羟喹组第5天逃避潜伏期明显缩短,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,表2)。

表2各组小鼠给药后逃避潜伏期比较(s,x±s)

空间探索实验结果显示,联合给药组目标象限游泳时间最大(27.0±5.0)%,其次为多奈哌齐组(23.7±4.4)%、氯碘羟喹组(22.9±3.8)%、空颗粒组(19.5±5.0)%、AD模型组(16.0±4.5)%;联合给药组、多奈哌齐组、氯碘羟喹组明显高于AD模型组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。空颗粒组与AD模型组目标象限游泳时间比较,无统计学差异(P>0.05)。

2.3各组小鼠海马AchE和Aβ表达比较

与其他4组比较,联合给药组海马AchE和Aβ表达最低(图1～2)。

图1各组小鼠海马AchE表达

图2各组小鼠海马Aβ表达

2.4各组苏木精-伊红染色比较

苏木精-伊红染色显示,实验组海马CA1区细胞排列稀疏,细胞层次减少,细胞数目减少;对照组海马CA1区细胞排列紧密,细胞层次较多,细胞数目多(图3～4)。高协同纳米递药系统给药后,联合给药组、多奈哌齐组、氯碘羟喹组海马CA1区较AD模型组细胞排列紧密,细胞数目增多;空颗粒组海马CA1区较AD模型组未见明显改变(图5～9)。

图3实验组图4对照组图3～4海马CA1区细胞苏木精-伊红染色×400

图5联合给药组图6多奈哌齐组图7氯碘羟喹组图8空颗粒组图9AD模型组图5～9各组给药后海马CA1区细胞形态苏木精-伊红染色×400

图10联合给药组图11多奈哌齐组图12氯碘羟喹组图13空颗粒组图14AD模型组图10～14各组给药后海马Aβ表达（箭头所示）免疫组织化学染色×100

表3各组额区和颞区各频带功率比(x±s)

2.5各组免疫组织化学染色比较

联合给药颗组小鼠海马Aβ沉积最少,其次为氯碘羟喹组,均较AD模型组减少(图10～14)。

2.6脑电总功率谱分析

额区:联合给药组、多奈哌齐组和氯碘羟喹组θ频带功率比明显低于AD模型组,联合给药组α+β频带功率比明显高于AD模型组(P<0.05,P<0.01)。颞区:联合给药组θ频带功率比明显低于AD模型组,α+β频带功率比明显高于AD模型组(P<0.05,表3)。

3、讨论

AD是与年龄相关的神经退行性疾病,是老年痴呆最常见的原因[6]。1976年,Davies和Maloney首次提出胆碱能神经元和乙酰胆碱减少可致记忆功能衰退,故增加脑中乙酰胆碱水平是治疗AD的重要靶点[7]。由此,临床最常采用的多奈哌齐为胆碱酯酶抑制剂,可通过抑制AchE,减少乙酰胆碱的水解,相对增加脑内乙酰胆碱含量,改善AD的临床症状。本研究中,经鼻给药后,Westernblot检测显示,联合给药组小鼠海马AchE表达低于多奈哌齐组、氯碘羟喹组、空颗粒组、AD模型组,表明多奈哌齐确实可以通过血脑屏障进入脑海马组织,抑制AchE,且联合给药的疗效优于单一给药。同时Morris水迷宫空间探索实验中,联合给药组目标象限游泳时间占总时间最大,其次为多奈哌齐颗粒、氯碘羟喹颗粒、空颗粒组、AD模型组,其中联合给药组和多奈哌齐组与AD模型组比较,差异有统计学意义,提示联合给药组、多奈哌齐组小鼠学习能力、记忆能力增强,此结果与上述结果一致,且联合给药组效果最好。

Aβ假说认为大脑中沉积的Aβ是AD主要的病理原因。正常情况下,Aβ产生和降解保持平衡,Aβ稳态失衡促使Aβ沉积进而导致AD[8,9]。多项研究表明,AD患者脑中锌水平变化可影响淀粉样蛋白沉积,以此为靶点,在AD治疗中应用较广泛的氯碘羟喹,为锌离子螯合剂,通过破坏锌离子与Aβ的相互作用,可抑制Aβ聚集与过氧化反应,避免造成进一步的神经元损伤和死亡,从而延缓AD进程改善AD症状。本研究中,Westernblot结果显示,联合给药组、氯碘羟喹组海马Aβ表达均低于AD模型组;免疫组织化学实验结果亦显示,联合给药组Aβ聚集量最少,其次为氯碘羟喹组,均表明锌离子螯合剂可进入脑组织,减少Aβ聚集沉积,且联合给药组Aβ表达量最少;同时,Morris水迷宫定位航行实验中第5天,联合给药组、氯碘羟喹组逃避潜伏期较AD模型组明显缩短,空间探索实验结果显示,联合给药组、氯碘羟喹组目标象限游泳时间明显高于AD模型组,提示AD小鼠学习记忆功能得到一定程度改善,锌离子螯合剂有可能通过减少Aβ沉积,从而改善AD模型小鼠学习和记忆功能。

AD患者的定量脑电图通常表现为高频率α及β活动减少,低频率θ及δ活动增加的特点[10]。AD患者所存在的胆碱能神经元缺失、神经突触间隙乙酰胆碱含量减少,可在功能上由突触电位的变化表现出来,并多以认知脑区慢波展现。本研究中,在额区,联合给药组、多奈哌齐组及氯碘羟喹组θ频带功率比明显低于AD模型组;联合给药组α+β频带高于其他4组,且与AD模型组比较有统计学意义。在颞区中,联合给药组θ频带功率比明显低于AD模型组,在α+β频带功率谱明显高于AD模型组。上述研究结果表明,载药颗粒可经鼻入脑,抑制乙酰胆碱分解,相对提高了认知脑区乙酰胆碱水平,从而改善脑功能,也证明针对发病机制的AD联合给药疗效好于单一给药治疗。

目前,AD的治疗方法均存在不同程度的缺陷或副作用:(1)以锌等金属离子的螯合剂(如氯碘羟喹)为主体的抗Aβ聚集治疗,大部分存在难以跨过细胞膜,不能有效破坏细胞内Aβ聚集的缺陷;(2)以AchE抑制剂(如多奈哌齐)为主体的药物治疗,口服药物存在胃肠道反应等副作用。高协同纳米递药系统经鼻给药能够有效实现2种治疗的协同作用,避免口服给药产生的胃肠道不良反应的同时,还因纳米递药系统的引入,实现更高效率,提高疗效。

本研究中应用的高协同纳米递药系统,利用该纳米递药系统的模块化制备技术,将靶向制剂(神经节苷脂)、跨膜肽TAT、锌离子螯合剂及AchE抑制剂进行组装,实现跨膜、靶向、缓释、抗Aβ聚集和抑制AchE治疗等多功能的高效协同。本研究结果表明,高协同纳米递药系统能够高效地将治疗药物递送入脑,并达到改善AD症状的目的,且针对多种发病机制的药物协同治疗较单一给药取得更好的疗效,其学习记忆能力改善更为显著。

参考文献：

[9]张赫,郑焱.β淀粉样蛋白级联假说相关的阿尔茨海默病发病机制及防治策略研究进展[J].中国医学科学院学报,2019,41(5):702-708.

牟苇杭,杨慧云,刘迢迢,陶华英.高协同纳米递药系统经鼻给药对淀粉样前体蛋白与早老素1转基因小鼠认知功能的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2020,22(09):974-978.