糖尿病周围神经病变(DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一。流行病学研究表明,约50%的糖尿病患者在疾病发展过程中出现了肢体麻木等周围神经病变的临床表现,其中约70%的DPN患者在确诊糖尿病五年内发病[1-4]。DPN起病隐匿,早期症状不明显,存在诊断困难、诊断延迟的现象,晚期易造成神经不可逆性损伤,甚至发展为糖尿病足,严重者可能截肢[5],严重影响患者的生活质量和自理能力,因此,对DPN进行防治尤为重要。

DPN的发病机制尚未完全阐明,目前研究认为其与长期高糖导致的氧化应激反应、细胞凋亡、炎症反应、血管损伤、代谢紊乱及神经营养因子缺乏等多因素相关[6-7]。中医学根据其消渴日久的病因,结合肢体麻木、疼痛等临床表现,将其归属于“消渴痹症”的范畴,发病机制与气阴两虚、脉络瘀阻密切相关。基于上述认识,导师方朝晖教授团队结合多年临床经验,以益气活血、化瘀通络为治法,研制出院内制剂芪归通络颗粒,广泛用于DPN气虚血瘀型患者的治疗,临床疗效显著。前期研究表明,芪归通络颗粒具有抗氧化应激、抑制炎症、改善微循环及神经保护等作用[8-10]。本研究旨在通过动物实验,进一步评估芪归通络颗粒治疗DPN的疗效,探讨其潜在的作用机制,为中医药治疗DPN提供科学依据。研究方案已通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查,编号:AZYFY-2024-1001。

1、材料

1.1动物

SPF级雄性SD大鼠60只,体质量200~250g,由安徽省立医院动物实验中心提供,动物生产许可证号:SCXK(浙)2019-0001。所有大鼠饲养于安徽省立医院动物实验中心动物房,室温20~25℃,湿度40%~60%,自主进食饮水,12h昼夜光照节律。

1.2主要药品与试剂

芪归通络颗粒(原名:芪归糖痛宁颗粒,规格10g/袋,批号:皖药制备字Z20200009000),安徽中医药大学第一附属医院制剂中心生产;甲钴胺片(批号:H20051440),江西青锋药业有限公司;链脲佐菌素(STZ,批号:S0130),美国西格玛公司;大鼠白细胞介素(IL)-6试剂盒(货号:KS12244)、丙二醛(MDA)试剂盒(货号:KS13297)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(货号:KS11065)、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(货号:KS18087),上海科顺生物科技有限公司;核因子E2相关因子2(Nrf2)抗体(货号:80593-1-RR)、NF-κBp65抗体(货号:10745-1-AP)、核因子B抑制蛋白α(IκBa)抗体(货号:10268-1-AP),美国派普泰克公司;Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)抗体(货号:A25175)、β-actin抗体(货号:AC026)、逆转录试剂盒(货号:RK20403)、RNA扩增试剂盒(货号:RK21203),武汉爱博泰克生物科技有限公司;二抗(货号:BL003A),北京兰杰柯科技有限公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(货号:C831100-0200)、总RNA提取试剂盒(货号:B618583),上海生工生物工程股份有限公司。

1.3主要仪器

Mini型蛋白转膜仪,北京君意东方电泳设备有限公司;Mycycler常规PCR仪、IQ5实时荧光定量PCR仪,伯乐生命医学产品(上海)有限公司;754PC紫外可见分光光度计,上海菁华科技仪器有限公司;FTSY96型酶标仪,山东风途物联网科技有限公司;CONTOURŹPLUS血糖仪,德国拜耳医药保健有限公司。

2、方法

2.1分组与干预

60只大鼠适应性喂养1周后,随机选取10只作为空白对照组,以普通饲料喂养。其余50只大鼠高脂饲料喂养2周后,一次性腹腔注射STZ(40mg/kg),72h后检测尾尖血糖,血糖≥16.7mmol/L者判定糖尿病模型成功,血糖未达标的大鼠3d后再注射一次STZ,测血糖达标者纳入下一步实验,否则剔除。造模成功的大鼠继续高脂饲料喂养2周,当出现机械痛阈值(PWMT)下降和足底热敏反应时间延长[11-12],则判定DPN造模成功。造模成功后将大鼠随机分为模型组、芪归组和甲钴胺组,各组大鼠进行灌胃治疗。参考2010版《药理实验方法学》[13]计算出大鼠每日给药剂量,芪归组予芪归通络颗粒灌胃(3.15g/kg);甲钴胺组予甲钴胺片灌胃(0.16mg/kg);空白组和模型组以0.9%氯化钠溶液灌胃(5mL/kg)。每日1次,共灌胃8周。实验期间,对血糖值≥25mmol/L的大鼠每周皮下注射少量胰岛素,以防止高血糖导致的死亡。

2.2处死与取材

末次灌胃给药后,禁食12h,1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉,检测坐骨神经传导速度(MNCV),腹主动脉采血,离心,取上层血清,分装标记后保存于-80℃冰箱中备用。剪开大鼠下肢皮肤,取出坐骨神经,左侧浸泡在4%多聚甲醛溶液中,右侧置于冻存管中冻存备用。

2.3观察指标与方法

2.3.1一般情况

每日观察大鼠的活动状态、毛色、进食、饮水、二便等一般情况。

2.3.2大鼠血糖及体质量

每2周测量一次大鼠体质量,分别于给药前及给药后8周测量大鼠尾尖血糖。

2.3.3大鼠机械痛阈值

将实验大鼠放置于多孔测试笼中,暴露足底,自由活动30min,使其适应实验环境,待大鼠安静后,使用vonFrey丝刺激足底,每次刺激持续1~2s,防止过度刺激或伤害大鼠,仔细观察大鼠的行为反应,记录快速缩足时的力度。同一部位测量3次,每次间隔2min,将3次测量的结果取平均值,即得到大鼠的PWMT值。

2.3.4大鼠运动神经传导速度

大鼠麻醉后置于恒温垫上,将刺激电极第一记录电极置于大鼠右下肢坐骨切迹坐骨神经传出位置,第二记录电极置于右侧踝关节坐骨神经分布位置,记录从刺激开始到复合动作电位出现的时间,使用卡尺测量两个电极之间的距离。共测量3次,结果取平均值。神经传导速度的计算公式为:MNCV(m/s)=电极点之间的距离/复合动作电位出现的时间。

2.3.5大鼠血清IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平检测

采用ELISA法检测大鼠血清中IL-6、TNF-α、SOD和MDA的含量,严格按照试剂盒说明书步骤进行操作。

2.3.6HE染色观察大鼠坐骨神经病理形态

采用HE法观察坐骨神经的微观结构和组织形态。从固定液中取出坐骨神经样本,洗涤,脱水,透明,浸蜡后包埋,切片,二甲苯脱蜡,HE染色,乙醇脱水后封片,显微镜下观察。

2.3.7Westernblot检测坐骨神经IκBa、NFκB、Nrf2、Keap1蛋白表达

取大鼠坐骨神经组织剪碎,液氮充分研磨,加入RIPA裂解液,离心,取上清,测定蛋白浓度,蛋白变性,制胶,上样,电泳,转膜,封闭,分别加入一抗Nrf2(1︰1000)、IκBa(1︰5000)、NF-κBp65(1︰1000)和Keap1(1︰500)4℃孵育过夜,二抗室温孵育30min,化学发光法显影。

2.3.8RT-qPCR检测坐骨神经IκBa、NF-κB、Nrf2、Keap1mRNA表达

提取坐骨神经组织总RNA,进行浓度和纯度测定,通过逆转录过程,随后进行PCR扩增。PCR反应条件:95℃预变性3min,95℃变性5s,60℃退火延伸30s,循环重复40次。以β-actin为内参,采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。实验所需引物由合肥德尔谱生物科技有限公司设计并合成,引物序列见表1。

表1引物序列

2.4统计学方法

使用SPSS25.0软件进行统计学处理与分析。计量资料用均数±标准差(x୰±s)表示,先进行单因素方差分析,方差齐者采用LSD法进行多重比较,方差不齐者采用Tambane’sT2法进行比较,P<0.05代表差异有统计学意义。

3、结果

3.1一般情况比较

实验期间,空白组大鼠精神状态良好,活动自如,反应灵敏,毛色、皮肤、饮食及二便均正常;造模后大鼠摄食量与进水量增加、排泄物增多、毛色暗淡、精神萎靡,体质量较前有所下降,个别大鼠出现躁动不安、偏瘫的情况,药物干预后,给药组大鼠上述症状有所缓解。

3.2各组大鼠体质量比较

治疗前,与空白组比较,模型组大鼠体质量明显下降(P<0.05);治疗后,与模型组比较,芪归组和甲钴胺组大鼠体质量明显上升(P<0.05)。见表2。

表2各组大鼠体质量比较

3.3各组大鼠血糖比较

治疗前,与空白组比较,模型组大鼠血糖显著上升(P<0.05);治疗后,与模型组比较,芪归组大鼠血糖显著下降(P<0.05)。见表3。

表3各组大鼠血糖比较

3.4各组大鼠机械痛阈值与神经传导速度比较

与空白组比较,模型组大鼠机械痛阈值与神经传导速度均显著降低(P<0.05);与模型组比较,芪归组与甲钴胺组机械痛阈值、神经传导速度均显著增加(P<0.05)。见表4。

表4各组大鼠机械痛阈值(PWMT)和神经传导速度

3.5各组大鼠炎症与氧化应激指标水平比较

与空白组比较,模型组大鼠血清IL-6、TNF-α以及MDA水平均显著升高(P<0.05),SOD的活性明显降低(P<0.05);与模型组比较,芪归组和甲钴胺组大鼠IL-6、TNF-α和MDA水平均显著降低(P<0.05),SOD活性明显上升(P<0.05)。见表5。

表5各组大鼠炎症与氧化应激指标水平比较

3.6各组大鼠坐骨神经病理形态比较

HE染色结果(图1)显示,正常组大鼠坐骨神经纤维排列紧密有序,整体结构清晰。模型组大鼠坐骨神经纤维数量明显减少,神经纤维分布较稀疏,可见明显的纤维变性断裂,部分纤维髓鞘呈现节段性脱失改变。芪归组和甲钴胺组大鼠坐骨神经纤维变性断裂现象显著改善,排列更为规整,脱髓鞘程度减轻。

图1各组大鼠坐骨神经HE染色

3.7各组大鼠坐骨神经Nrf2、IκBa、NFκBp65、Keap1蛋白表达比较

与空白组比较,模型组大鼠Nrf2、IκBa蛋白水平显著降低(P<0.01),NF-κBp65、Keap1蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,芪归组和甲钴胺组大鼠Nrf2、IκBa蛋白水平显著上升(P<0.05),NF-κBp65、Keap1蛋白水平显著降低(P<0.05)。见图2、图3。

图2各组大鼠坐骨神经Nrf2、IκBa、NF-κBp65、Keap1蛋白免疫印迹图

3.8各组大鼠坐骨神经Nrf2、IκBa、NFκBp65、Keap1mRNA表达比较

与空白组比较,模型组大鼠Nrf2、IκBamRNA水平显著降低(P<0.01),NF-κBp65、Keap1mRNA水平显著上升(P<0.01);与模型组比较,芪归组和甲钴胺组大鼠Nrf2、IκBamRNA水平显著上升(P<0.01),NF-κBp65、Keap1mRNA水平显著降低(P<0.05)。见图4。

图3各组大鼠坐骨神经Nrf2、IκBa、NF-κBp65、Keap1蛋白表达比较

图4各组大鼠坐骨神经Nrf2、IκBa、NF-κBp65、Keap1mRNA表达比较

4、讨论

DPN在中医古籍中无明确对应病名,但根据其临床症状及病因病机,可归属于“消渴痹证”“血痹”“麻木”等范畴[14-15]。其核心病机在于消渴日久,耗伤气阴,气虚则无力运血,阴虚则脉络失濡,进而导致脉络瘀阻。血瘀作为关键病理因素,贯穿DPN发展的全过程。患者在正气亏虚的基础上,常兼夹痰浊、寒湿或湿热等病理产物,进一步损伤脉络,致使肢体、经脉失于濡养,终致麻木、痹痛等症状出现[16]。基于这一病机认识,方朝晖教授创立了以“益气活血、化瘀通络”为治法的中药制剂———芪归通络颗粒。方中黄芪、当归共为君药,黄芪功专补益中焦之气,气旺则血行畅达,兼能通脉除瘀,契合“补气以行血”治则;当归具甘润补血、辛散行血之双向调节特性,既补营血之虚,又行脉道之滞,二者相须为用,标本兼顾,祛瘀而不伤正。臣药配伍葛根-生地黄:葛根升举清阳以布散津液,生地黄滋阴凉血兼清伏热,二者协同助君药实现“益气-活血-生津”三位一体的治疗目标。佐以鸡血藤活血通络兼补血生新,配伍延胡索辛开苦降以行气活血,既增强主药活血化瘀之效,又防过剂伤正。使药独取威灵仙,性善走窜,不仅能祛风除湿、通络止痛,更具引经报使之功,借其通行十二经之特性,引诸药直达病所。

DPN的病理机制研究表明,氧化应激反应在疾病发生发展中起关键作用。高糖代谢状态下,细胞内葡萄糖氧化代谢持续活化导致活性氧(ROS)大量积聚,当超过线粒体清除能力时,将引发神经细胞损伤。MDA作为脂质过氧化的终末产物,其含量可客观反映机体氧化损伤程度;而SOD作为重要的抗氧化酶,通过清除超氧阴离子维持氧化还原平衡[17-19]。本研究发现,芪归通络颗粒能显著降低MDA含量并提高SOD活性,同时通过调控Keap1/Nrf2信号通路,上调Nrf2表达、下调Keap1表达,促进Nrf2与抗氧化反应元件(ARE)结合,从而激活下游抗氧化酶的表达,改善坐骨神经损伤。这些结果证实Keap1过表达导致的Nrf2活化障碍参与DPN发病,而芪归通络颗粒可通过多靶点作用缓解氧化应激损伤。

近年研究发现,氧化应激与炎症反应通过“氧化-炎症轴”协同促进DPN进展。在高糖环境下,周围神经损伤导致TNF-α、IL-6等炎性介质释放,通过Toll样受体等激活NF-κB信号通路。NF-κB抑制剂IκB蛋白磷酸化降解使NF-κB核转位,上调炎性基因表达,加剧炎症反应和神经元凋亡[20-21]。本实验结果显示,芪归通络颗粒可降低IL-6、TNF-α水平,上调IκBa表达并下调NF-κBp65表达,表明其通过抑制NF-κB通路活化减轻炎症反应。这提示DPN的发生发展与NF-κB通路异常激活导致的炎性级联反应密切相关。

综上所述,芪归通络颗粒可能通过调控Nrf2/NF-κB信号通路,减轻炎症反应、改善氧化应激损伤,保护神经组织。

参考文献:

[8]陈文娟.芪归糖痛宁方治疗气虚血瘀型2型糖尿病周围神经病变的临床疗效观察及对IGF-1､hs-CRP的影响[D].合肥:安徽中医药大学,2023.

[9]刘蒙蒙.芪归糖痛宁颗粒对2型糖尿病周围神经病变患者临床疗效观察及对模型大鼠PERK､CHOP表达影响[D].合肥:安徽中医药大学,2020.

[10]姜志妮.芪归糖痛宁颗粒治疗气虚血瘀型2型糖尿病周围神经病变临床疗效观察及对血清TNF-α､IL-10､CD40及CD40L的影响[D].合肥:安徽中医药大学,2022.

[11]周雯,方颖,储全根,等.黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠血清IL-1β､TNF-α､NGF和坐骨神经NGFmRNA的影响[J].安徽中医药大学学报,2020,39(3):67-71.

[12]王长琴,张婷婷,徐艳,等.黄芪箭丸对糖尿病周围神经病变大鼠核转录因子-κB及降钙素基因相关肽表达的影响及研究[J].中华中医药学刊,2022,40(7):247-250.

[13]魏伟,吴希美,李元建.药理实验方法学[M].4版.北京:人民卫生出版社,2010:212.

[14]国家中医药管理局.22个专业95个病种中医诊疗方案[M].北京:中国中医药出版社,2010:177.

[15]庞国明,孙扶,谢卫平,等.中医药治疗糖尿病周围神经病变临床研究进展[J].世界中西医结合杂志,2020,15(12):2339-2342.

[16]魏萱.中医药治疗糖尿病周围神经病变研究进展[J].河北中医,2023,45(7):1203-1207.

[18]范茗华,王哲佳,徐小凡,等.丙二醛､谷胱甘肽过氧化物酶与2型糖尿病的相关性研究[J].赣南医科大学学报,2025,45(1):53-57.

基金资助:国家自然科学基金项目(82174153);安徽省高校协同创新项目(GXXT-2020-025);合肥综合性国家科学中心大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所“揭榜挂帅”项目(2023CXMMTCM003);

文章来源:朱梦燕,方朝晖,李瑜璠,等.芪归通络颗粒对糖尿病周围神经病变大鼠坐骨神经Nrf2/NF-κB通路的影响[J].中国中医基础医学杂志,2025,31(08):1384-1388.