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新型肠促胰岛素类似物对糖尿病脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的影响

2021-11-05 48 上传者：管理员

摘要：目的研究新型胰高血糖素样肽1和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽双受体激动剂(DA3-CH)是否可通过激活核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路减轻糖尿病脑缺血再灌注大鼠的氧化应激损伤。方法选取SPF级雄性SD大鼠36只,随机选取24只进行糖尿病造模后分为模型组和DA3-CH组,其余12只为空白组(n=12)。模型组和DA3-CH组制备脑缺血再灌注模型,DA3-CH组腹腔注射DA3-CH。检测各组改良神经功能缺损评分(mNSS),Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)和醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白表达,超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛水平。结果与空白组比较,模型组和DA3-CH组血糖、mNSS、脑梗死面积、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达及丙二醛水平升高,SOD活性降低(P<0.01)。DA3-CH组血糖、mNSS、脑梗死面积、丙二醛水平明显低于模型组[(21.50±1.52)mmol/Lvs(24.53±2.53)mmol/L,(8.75±1.66)分vs(12.58±1.73)分,(12.35±3.68)%vs(39.43±3.05)%,(2.52±0.41)nmol/mgvs(4.69±0.43)nmol/mg,P<0.01];DA3-CH组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达及SOD活性明显高于模型组(P<0.01)。结论新型肠促胰岛素类似物DA3-CH可通过激活Nrf2/ARE通路减轻糖尿病脑缺血再灌注大鼠的氧化应激损伤。

关键词：
丙二醛
氧化性应激
肠促胰岛素类
血红素加氧酶-1
超氧化物歧化酶
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缺血性脑卒中约占卒中总数的80%,严重危害社会健康，目前有效的治疗方法包括静脉溶栓、机械取栓等。然而，再灌注后发生脑缺血再灌注损伤(CIRI)可导致患者产生更为严重的神经损伤和功能缺损。高糖可促进氧自由基大量产生及清除能力减弱，合并糖尿病的脑卒中患者常处于更高的氧化应激水平[1]。因此，抗氧化应激可作为减轻糖尿病CIRI的重要靶点。核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路是内源性抗氧化应激最主要的通路，将该通路作为研究抗氧化应激机制的切入点。肠促胰岛素是由肠道内分泌细胞分泌的一类多肽激素，胰高血糖素样1(GLP-1)和葡萄糖依赖性胰岛素分泌多肽(GIP)是其主要成员。研究表明，肠促胰岛素类似物在帕金森病、阿尔茨海默病等中枢神经系统疾病中可通过抗氧化应激发挥神经保护作用[2,3,4,5,6,7]。胰高血糖素样肽1和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽双受体激动剂(DA3-CH)是一种新型肠促胰岛素类似物，可同时激活GLP-1和GIP受体，本研究将DA3-CH作用于糖尿病脑缺血再灌注大鼠，探究其是否可通过抗氧化应激发挥神经保护作用，是否与激活Nrf2/ARE通路相关。

1、材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠36只，体质量280～320g,8～12周龄，购于斯贝福(北京)生物技术有限公司[SCXK(京)2019-0010],自由饮食，湿度50%～55%、室温19～25℃,光照12h/d。

1.2 主要试剂

DA3-CH(获赠于ChristianHölscher教授);大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓(北京西浓科技);链脲佐菌素STZ、2,3,5-三苯基四氮唑(TTC,美国Sigma);丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成);苏木精-伊红染色试剂盒、增强型RIPA裂解夜、蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)、增强化学发光检测盒(ECL,博士德，中国);Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)抗体(Abcam,英国);醌氧化还原酶1(NQO1)抗体(武汉三鹰);β肌动蛋白(β-actin)抗体(Bioworld,美国)。

1.3 动物分组和模型建立

SPF级雄性SD大鼠36只随机选取24只进行糖尿病造模，12只非糖尿病大鼠为空白组，24只糖尿病大鼠随机分为模型组和DA3-CH组(n=12)。DA3-CH组腹腔注射DA3-CH(10nmol/kg,1次/d),空白组、模型组腹腔注射等体积生理盐水，连续14d,监测血糖、体质量。14d后模型组、DA3-CH组制备脑缺血再灌注模型，空白组只暴露动脉不做栓塞处理。由于该模型有一定死亡率，在实验期间及时补充实验大鼠，保证每组大鼠数量。糖尿病造模方法：大鼠适应性喂养3d,禁食8h后给予腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg,足量饮食72h后，采大鼠尾静脉血测定随机血糖，血糖≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功。

采用线栓法制备短暂性MCAO模型。腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)进行麻醉，固定消毒后，行颈部正中切口，分离右侧的颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉，在颈外动脉剪口，从剪口处穿入长度适宜的头端略圆钝、膨大的线栓，经颈内动脉入颅封堵大脑中动脉，固定好线栓，缺血2h后拔出线栓，形成再灌。行Longa评分1～3分即为造模成功。

1.4 血糖测定和改良神经功能缺损评分(mNSS)

再灌注24h后，测尾静脉血糖，并使用mNSS评估神经功能缺损的严重程度，对大鼠运动、感觉、平衡、肌张力、异常活动等进行评估，评分范围为0～18分。mNSS评分越高代表神经功能缺损越严重。

1.5 TTC染色并测量脑梗死面积

每组随机选取3只大鼠，麻醉后生理盐水心脏灌注，冰上迅速断头取脑，去除小脑和脑干，切片(共5片)。将其放入2%的TTC中37℃避光孵育30min,多聚甲醛固定12h以上。拍照后使用ImageJ软件计算每个脑切片的总面积和梗死面积，计算梗死面积百分比。

1.6 苏木精-伊红染色

每组中随机选取3只大鼠，生理盐水心脏灌注后4%多聚甲醛灌注取脑，脱水后石蜡包埋。切片、染色，显微镜下观察并拍照，研究组织病理形态。

1.7 Westernblot检测Nrf2和HO-1及NQO1蛋白表达

再灌注24h后，将各组6只大鼠迅速断头取脑，置于-80℃的冰箱中速冻8～10min,刀片切取缺血半暗带脑组织标本，-80℃冰箱保存备用。BCA法进行蛋白定量。采用ECL发光液在成像系统进行曝光。用ImageJ软件测定Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin蛋白条带灰度值，以相对灰度值(目的蛋白/内参)表示蛋白的表达水平。

1.8 氧化应激相关指标测定

取上述缺血半暗带脑组织，根据说明书步骤，采用水溶性四唑盐法测定SOD活性及硫代巴比妥酸法测定丙二醛水平。

1.9 统计学方法

采用SPSS26.0软件进行统计学分析，数据均为计量资料，以x¯±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 3组血糖和mNSS的比较

空白组、模型组和DA3-CH组血糖分别为(7.87±1.28)mmol/L、(24.53±2.53)mmol/L和(21.50±1.52)mmol/L。3组血糖水平和mNSS比较，有统计学差异(P=0.000)。与空白组比较，模型组和DA3-CH组血糖水平和mNSS升高(P<0.01),且DA3-CH组血糖水平和mNSS明显低于模型组(P<0.01,表1)。

2.2 各组脑梗死面积比较

TTC染色显示，空白组染色均匀一致，为红色；DA3-CH组脑梗死面积小于模型组(图1)。3脑梗死面积比较，有统计学差异(P=0.000)。与空白组比较，模型组、DA3-CH组脑梗死面积明显增大(P<0.01),DA3-CH组脑梗死面积明显低于模型组(P<0.01,表1)。

2.3 3组脑组织病理形态比较

空白组脑组织细胞形态大小基本一致，分布均匀，胞质充盈，核仁清晰；与空白组比较，模型组、DA3-CH组均可见脑组织细胞受损严重，分布相对稀疏，出现较多空泡状水肿、变性，以及核固缩和核溶解；与模型组比较，DA3-CH组空泡状水肿、变性，以及核固缩、核溶解情况有所减轻(图2～4)。

2.4 各组Nrf2和HO-1及NQO1蛋白表达水平比较

与空白组比较，模型组和DA3-CH组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平明显升高(P<0.01),且DA3-CH组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.01,图5,表2)。

2.5 3组氧化应激相关指标比较

3组丙二醛和SOD活性比较，差异有统计学意义(P=0.000)。与空白组比较，模型组和DA3-CH组丙二醛水平明显升高[(4.69±0.43)nmol/mg和(2.52±0.41)nmol/mgvs(1.21±0.05)nmol/mg,P<0.01],SOD活性明显降低[(122.74±7.69)U/mg和(161.42±6.96)U/mgvs(226.95±5.32)U/mg,P<0.01]。DA3-CH组丙二醛水平明显低于模型组，SOD活性明显高于模型组(P<0.01)。

3、讨论

肠促胰岛素类似物是一类新型降糖药物，可通过抑制食欲、降低胰高血糖素的分泌、增加胰岛素的合成和分泌等方式发挥降糖作用。降低血糖可改善糖尿病脑缺血再灌注大鼠的微血管功能，减轻氧化应激以及神经功能缺损，减少血脑屏障渗漏及脑水肿发生，从而减轻神经损伤[8]。本研究中，DA3-CH组大鼠的血糖、mNSS及脑梗死面积均较模型组明显降低，组织病理损伤减轻，证明了DA3-CH对糖尿病CIRI大鼠的神经保护功能是确切的，降低血糖在一定程度上减轻了神经损伤。然而，肠促胰岛素能够通过血脑屏障，作用于大脑中分布广泛的GLP-1、GIP受体，其类似物在癫痫、帕金森病等神经系统疾病模型中不影响血糖仍能减轻神经损伤[7,9]。这说明DA3-CH除降低血糖外还通过其他途径来减轻糖尿病大鼠的CIRI。

氧化应激是指有害刺激引起的氧化和抗氧化作用失衡，导致体内活性氧积蓄，造成细胞、组织氧化损伤的过程。脑组织含有丰富的易被氧化的不饱和脂肪酸，且抗过氧化能力及清除自由基的能力低于其他组织，极易发生氧化应激损伤。丙二醛是脂质过氧化反应的最终产物，可间接反映机体细胞受氧化应激损伤的严重程度；SOD是清除活性氧的主要酶类，其活力高低间接反映了机体的抗氧化应激能力，故通常用丙二醛和SOD来反映机体的氧化应激损伤水平。本研究DA3-CH组丙二醛水平较模型组明显下降，SOD活力明显升高，证实DA3-CH能有效降低脑组织的氧化应激损伤。Nrf2是调控内源性抗氧化应激的重要转录因子，受到活性氧刺激时，可促进下游基因的转录及多种抗氧化酶及Ⅱ类解毒酶等的生成，如HO-1、NQO1、SOD、谷胱甘肽硫转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等，提高细胞、组织抗氧化能力[10]。Nrf2/ARE通路除抗氧化应激外还可通过抗炎、调节线粒体分裂和细胞凋亡、保护血脑屏障等多种途径减轻CIRI,是缺血性脑卒中高价值的治疗靶点[11]。脑缺血再灌注动物模型Nrf2及下游HO-1、NQO1、GSH-Px蛋白表达增加，Nrf2表达缺失后脑梗死面积及神经功能缺损加重[10]。HO-1可催化血红素分解成胆红素、胆绿素、Fe2+、CO,其分解产物具有抗氧化应激功能，NQO1可催化醌类及其衍生物还原并使其毒性降解，阻止进一步参加氧化还原及产生活性氧，二者表达增多可减轻脑组织的缺血再灌注损伤[12]。本研究中模型组Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达水平较空白组明显增加，证实了Nrf2/ARE通路对糖尿病大鼠脑缺血再灌注的应答，DA3-CH组进一步升高，说明DA3-CH可激活Nrf2/ARE通路发挥抗氧化应激作用，但其具体调控机制尚不明确。

综上所述，DA3-CH可通过抗氧化应激来减轻糖尿病大鼠的CIRI,从而发挥神经保护作用，作用机制与激活Nrf2/ARE通路相关，为肠促胰岛素类似物的临床应用提供科学依据。

文章来源：韩玉迪,李东芳,白波,王美琴.新型肠促胰岛素类似物对糖尿病脑缺血再灌注大鼠氧化应激损伤的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2021,23(11):1205-1208.