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艳山姜挥发油用CaMKⅡ改善糖尿病诱导视网膜Müller细胞自噬障碍

2023-10-18 153 上传者：管理员

摘要：目的探讨艳山姜挥发油(EOFAZ)对糖尿病诱导视网膜Müller细胞功能障碍的保护作用及机制。方法视网膜Müller细胞使用不同剂量的EOFAZ进行预处理1 h后，采用高糖(30 mmol·L-1)孵育48 h,Western blot法检测细胞中自噬信号Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达水平；qRT-PCR分析细胞中P62 mRNA、Beclin1 mRNA的转录水平，免疫荧光实验分析LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的表达。并进一步使用钙离子螯合剂BAPTA-AM及CaMKⅡ特异性抑制剂KN93孵育细胞，检测自噬信号LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、P62蛋白表达水平。使用自噬抑制剂氯喹(CQ)孵育细胞，检测细胞中CaMKⅡ及自噬信号LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表达。结果与高糖组相比，EOFAZ可明显上调Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的表达水平；使用BAPTA-AM及KN93孵育细胞与EOFAZ的作用类似。同时观察到EOFAZ与BAPTA-AM或KN93联合应用后，与EOFAZ单独作用的结果无明显差异。当EOFAZ与CQ共同孵育细胞后，EOFAZ对自噬相关蛋白下调的改善作用可被抑制，对CaMKⅡ的磷酸化水平无明显影响。结论 EOFAZ对高糖诱导的视网膜Müller细胞自噬障碍具有明显的改善作用，其作用可能是通过抑制CaMKⅡ信号发挥的。

关键词：
CaMKⅡ
糖尿病
自噬障碍
艳山姜挥发油
视网膜Müller细胞
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糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病常见且严重的微血管并发症之一，是导致糖尿病患者视力障碍和失明的最主要原因[1,2,3]。

研究表明，DR早期，视网膜Müller细胞（RMCs）功能异常是诱发DR患者失明的关键因素[4]。在DR发病早期，RMCs已先于视网膜血管内皮细胞、周细胞出现病理改变[5]。

自噬在细胞内环境稳态的维持中发挥着重要作用，在病理条件下，自噬功能紊乱可诱导细胞功能障碍，最终诱导包括心肌病、DR等多种疾病的发生[6]。DR应激下RMCs损伤与自噬障碍密切相关[7]。视网膜神经细胞的正常存活依赖于RMCs，深入探讨RMCs在DR中的发病机制，对早期诊断、治疗DR具有重大意义。

研究表明，钙依赖蛋白调节激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-dependent kinasesⅡ，CaMKⅡ）是治疗糖尿病引起的神经病变所致视力丧失的潜在靶点，是介导DR的主要因子[8,9]。前期课题组研究证实在糖尿病大鼠或是高糖应激下的RMCs中，CaMKⅡ的磷酸化明显增加，参与了神经元的生理和病理事件[10]。抑制Ca MKⅡ的磷酸化可改善血管性痴呆诱导大鼠海马神经元自噬功能障碍[11]。但CaMKⅡ的磷酸化是否介导高糖诱导的RMCs自噬功能障碍尚不明确。

贵州地产民族药艳山姜为姜科山姜属植物艳山姜Alpinia zerumbet(Pers.)Burttet Smith的干燥成熟果实，具有温中燥湿、行气止痛、截疟之功效[12,13]。前期课题组研究证实，艳山姜的主要有效成分为挥发油（essential oil from Fructus Alpiniae zerumbet,EOFAZ）。前期体内外研究显示EOFAZ对DR具有显著的改善作用[10,13]，但EOFAZ对高糖诱导的RMCs自噬功能障碍的作用以及作用机制尚不明确。本研究以RMCs为研究对象，研究EOFAZ对高糖诱导RMCs自噬功能障碍的保护作用，为临床防治DR提供实验基础。

1、材料

1.1 细胞

大鼠RMCs（上海胤曦生物技术有限公司）。

1.2 试药

艳山姜采自贵州省贞丰县，经贵州医科大学药学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定为姜科植物Alpinia zerumbet Pers.Burttet Smith的干燥成熟果实（凭证标本号：No.20151018），采用水蒸气蒸馏法提取EOFAZ，收率为1.3%。准确称取EOFAZ，将其溶于适量二甲基亚砜溶液中，配制母液浓度为1×107μg·L-1，过滤除菌，分装冻存于-20℃。D-无水葡萄糖（批号为405A0918）、D-甘露醇（批号为1126F038）（北京索莱宝科技有限公司），LC3抗体（批号为14600-1-AP）、P62抗体（批号为18420-1-AP）、p-Ca MKⅡ抗体（批号为#12716）、Ca MKⅡ抗体（批号为#3362）（武汉三鹰生物技术有限公司）。Beclin1抗体（Abcam公司，批号为ab207612）。

1.3 仪器

3020-426多功能全波长酶标仪（美国Thermo公司），WAC-60灭菌锅（韩国DAIHAN Scientific公司），5810R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司），Universal HoodⅡ型实时荧光定量PCR系统仪、CFX型凝胶成像系统仪（美国Bio-Rad公司），免疫荧光显微镜（德国徕卡公司）。

2、方法

2.1 细胞培养及分组

RMCs培养于含10%胎牛血清及1%青链双抗的低糖DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。培养瓶中的细胞融合至85%时，按常规胰酶消化后进行细胞传代，待细胞融合至70%～80%，即可进行给药干预。

2.1.1 细胞药效实验分组

分为正常对照组（含糖量5.5 mmol·L-1）、甘露醇组（24.5 mmol·L-1）、高糖组（HG，含糖量30 mmol·L-1）、EOFAZ低剂量（0.25μg·L-1)+HG组、EOFAZ中剂量（0.5μg·L-1)+HG组、EOFAZ高剂量（1.0μg·L-1)+HG组、阳性对照罗格列酮（RGZ,20μmol·L-1)+HG组；RMCs先用不同剂量的EOFAZ或RGZ预处理1 h，再用HG孵育48 h。其中甘露醇组用作HG组的渗透压对照。

2.1.2 机制作用实验分组

分为正常对照组（含糖量5.5 mmol·L-1）、高糖组（HG，含糖量30mmol·L-1）、EOFAZ高剂量（1μg·L-1)+HG组、BAPT-AM(5μmol·L-1）或KN93(5μmol·L-1）或氯喹（CQ)(10μmol·L-1)+HG组、EOFAZ高剂量（1μg·L-1)+HG+BAPT-AM或KN93或CQ组。RMCs先用EOFAZ、BAPT-AM、KN93或CQ预处理1 h，再用HG孵育48 h。

2.2 免疫荧光实验

在六孔板中放入盖玻片后将细胞接种于板中，在细胞融合至60%时给药。药物作用结束后将盖玻片取出置于PBS中静置10 min,4%多聚甲醛于室温固定15 min,0.2%Triton-100透化10min，山羊血清封闭30 min，一抗4℃过夜。次日将荧光二抗和DAPI按比例混合在一起后滴加到盖玻片上避光孵育1 h后，用PBS避光洗3次后，封片。于倒置荧光显微镜下采集照片。

2.3 免疫印迹分析

给药时间末，加入预冷PBS润洗3次，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。用10%SDS-PAGE将蛋白样品（25μg）进行电泳分离并将蛋白转移至PVDF膜。膜用含5%的BSA的TBST溶液封闭1 h后与所需的一抗在4℃下过夜孵育。第2日，膜用1×TBST洗3次后与二抗室温孵育1 h。膜洗3次后用ECL化学发光试剂盒进行显色，用BioRad凝胶成像系统进行曝光，用Image-Lab软件对数字图像进行量化。实验独立重复3次。

2.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

使用RNA提取试剂盒从RMCs中提取总RNA。mRNA被逆转录成c DNA,c DNA使用SYBR Green PCR试剂扩增。使用循环阈值法（2-ΔΔCt）进行分析。

2.5 统计学方法

实验数据均是从3个及以上独立的实验中获得，所有数据用GraphPad Prism 7.0(La Jolla,CA,USA）软件进行分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 EOFAZ对高糖诱导RMCs自噬功能障碍的影响

免疫印迹分析、qRT-PCR分别分析P62、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白及P62、Beclin1 mRNA表达，结果见图1。与正常对照组比较，高糖孵育RMCs 48 h后，细胞中自噬信号中Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白及P62、Beclin1 mRNA水平降低。EOFAZ预处理后可上调以上蛋白及mRNA的表达水平。

3.2 EOFAZ对高糖诱导RMCs中LC3、P62蛋白表达的影响

为了进一步研究EOFAZ对高糖诱导RMCs自噬功能障碍的影响，采用免疫荧光实验分析LC3、P62蛋白表达，结果见图2，与免疫印迹分析结果一致。EOFAZ可明显上调LC3水平，上调P62蛋白的表达水平，提示EOFAZ可明显改善高糖诱导的RMCs自噬功能障碍。

3.3 EOFAZ调控CaMKⅡ信号改善高糖诱导RMCs自噬功能障碍

前期课题组研究显示，在高糖应激下，RMCs中Ca MKⅡ的磷酸化水平明显增加，抑制Ca MKⅡ的磷酸化可改善血管性痴呆诱导大鼠海马神经元自噬功能障碍[11]。但Ca MKⅡ的磷酸化是否介导HG诱导的RMCs自噬功能障碍尚不明确。为了研究Ca MKⅡ的磷酸化是否介导HG诱导的RMCs自噬功能障碍，使用钙螯合剂（BAPTA-AM）及Ca MKⅡ特异性抑制剂（KN93）进行实验。结果如图3所示，与EOFAZ的作用类似，使用BAPTA-AM及KN93作用细胞可明显上调Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的表达水平。同时观察到EOFAZ与BAPTA-AM或KN93联合应用后，与EOFAZ单独孵育组无明显差异。

使用自噬抑制剂CQ孵育细胞，检测细胞中CaMKⅡ磷酸化水平及自噬信号Beclin1、LC3、P62蛋白的表达。结果如图3C所示，使用CQ可进一步抑制自噬，但对Ca MKⅡ的磷酸化水平无明显影响。提示EOFAZ对高糖诱导的RMCs自噬功能障碍具有明显的改善作用，其作用可能与抑制CaMKⅡ信号相关。

4、讨论

DR是糖尿病的一种微血管并发症，是成人视力丧失的主要原因。糖尿病中的RMCs损伤被认为是导致DR致病的主要因素，靶向RMCs损伤是预防早期DR的治疗策略[14]。

自噬是一种细胞内自我降解过程，负责去除、降解和回收细胞质蛋白和细胞器，涉及一系列连续的事件，Beclin1介导自噬的起始，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化参与自噬溶酶体膜的延伸直至自噬溶酶体的形成，P62与LC3Ⅱ蛋白结合形成复合物，并最终在溶酶体内降解。自噬在维持视网膜功能方面起着重要作用[15]。自噬功能障碍加速了RMCs损伤，自噬抑制DR的形成[6,14]。RMCs自噬异常在DR的发病机制及病程进展中起着关键作用。改善RMCs自噬功能障碍成为防治DR的研究焦点。本研究以自噬为切入点，以民族药活性成分EOFAZ为研究对象。在体外建立高糖诱导RMCs自噬功能障碍模型，探索EOFAZ的保护作用及其对自噬的调控作用。结果显示高糖作用后，细胞中Beclin1、P62表达水平显著降低，LC3Ⅱ/Ⅰ水平降低，提示RMCs自噬功能障碍，EOFAZ预处理可明显改善以上蛋白的异常表达。

前期课题组研究显示，在糖尿病应激作用下，RMCs中Ca MKⅡ的磷酸化水平明显增加[10]，抑制Ca MKⅡ的磷酸化可改善血管性痴呆诱导大鼠海马神经元自噬功能障碍[11]。但Ca MKⅡ的磷酸化在高糖诱导的RMCs自噬功能障碍中的作用尚不明确。为了研究Ca MKⅡ的磷酸化与自噬之间的关系，采用钙螯合剂（BAPTA-AM）及Ca MKⅡ特异性抑制剂（KN93）进行实验。结果表明，BAPTA-AM及KN93作用细胞后，可明显改善高糖诱导的RMCs自噬障碍。同时观察到两者分别与EOFAZ联合应用后，与单独的EOFAZ孵育组无明显差异。提示EOFAZ可能是通过调控Ca MKⅡ信号改善高糖诱导的RMCs自噬功能障碍。为了进一步证实该结论，使用自噬抑制剂CQ孵育细胞，分析Ca MKⅡ磷酸化水平及自噬信号蛋白的表达。结果如图3所示，CQ可进一步抑制自噬，但对Ca MKⅡ的磷酸化水平无明显影响。

综上所述，EOFAZ对高糖诱导的RMCs自噬功能障碍具有明显改善作用，其作用与调控CaMKⅡ信号相关，本研究为后期进一步研究EOFAZ改善糖尿病相关并发症提供实验依据，为民族药艳山姜防治糖尿病开拓新的理论指导与实验基础。

参考文献:

[4]张敏,周佳,沈玺,等.TXNIP在高糖诱导的小鼠视网膜Müller细胞自噬中的作用及相关机制[J].现代生物医学进展,2020,20(3):408-412.

[6]王立.EGCG激活自噬对高糖视网膜Müller细胞保护作用[D].苏州:苏州大学,2019.

[7]王立,颜世传,牛兰俊,等.高糖对体外培养视网膜Müller细胞自噬及凋亡的影响[J].中华眼视光学与视觉科学杂志,2022,24(1):17-26.

[12]张秀实.《贵州植物志》[M].成都:四川民族出版社,1989.

[13]杨红,林丹,李晨,等.艳山姜挥发油对高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞VEGF表达的调控作用[J].中药材,2018,41(3):686-690.

[15]唐霞,代艳,杨效竹.丹酚酸B对高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡､自噬及AMPK信号通路的影响[J].眼科新进展,2022,42(2):122-127.

文章来源:陈冰,杨红,杨惠,陈永鑫,甘诗泉,文波,蒋朝晖,沈祥春,李悦.艳山姜挥发油调控CaMKⅡ信号改善糖尿病诱导视网膜Müller细胞自噬障碍[J].中南药学,2023,21(10):2616-2621.