口腔唾液微生物群含有数百万种微生物，这些微生物每天随着吞咽转移至下消化系统。但许多因素阻碍微生物存活、定植及寄生于肠道，包括胃的酸度、胆汁酸、消化酶和十二指肠的抗菌蛋白。探究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)作为主要的牙周致病菌具有强耐酸性，可抵抗上述因素存活于肠道[1]。灌饲P.g小鼠可表现为糖耐量异常、胰岛素抵抗和更高的肌内脂肪组织含量受损[2]。所以，P.g与全身内分泌状态可能存在一定的相关性，且相互影响。

肠道以口腔为中介，具有吸收外界营养物质、抵御外界刺激及维持内外环境稳定的作用[3]。目前肠道屏障由生物屏障、化学屏障、物理屏障和免疫屏障组成[4]。生物屏障主要以肠腔菌群及黏膜菌群为主，结肠微生物组主要由厌氧菌组成，主要包括厚壁菌门(Firmicutes),拟杆菌门(Bacteroidetes),变形菌门(Proteobacteria) ,放线菌门(Actinobacteria)四大类[5]。特定的疾病可调节和影响肠道菌群，肠道微生物群通过影响宿主内分泌、神经和免疫途径来影响人体的基本功能，包括消化、能量代谢和炎症。大量研究结果显示，肠道菌群与2型糖尿病密切相关[6,7]。与正常人相比，2型糖尿病患者肠道菌群中芽孢杆菌属(Bacillus)、Bacteroides、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、Akkermansia及产丁酸菌显著减少，瘤胃球菌属(Ruminococcu)和Enterococcus显著增加，除此之外Bacteroides/Firmicutes及Firmicutes/Clostridium与血糖水平呈正相关。所以肠道微生物群可能是2型糖尿病及相关疾病治疗的新靶点。

本实验主要探究P.g通过口肠轴对糖尿病小鼠的影响及机制，进一步研究P.g对小鼠肠道微生物群、血糖控制和肠L细胞及其分泌物的影响，为牙周炎对糖尿病的影响提供更多依据。

1、材料与方法

1.1主要试剂及仪器

链脲佐菌素(streptozotocin, STZ,索莱宝科技有限公司);高脂高糖饲料(协同生物，60%高果糖纯化型饲料);P.g(ATCC33277,北纳生物有限公司);BHI固体培养基；小鼠GLP-1 ELISA试剂盒(Elabscience);RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司);cDNA反转录试剂(Prime ScriptTM RT masters Mix, TaKaRa);TB Green Premix Ex Taq(TaKaRa);HE染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司);qPCR仪(Bio-RAD);Infinite F50经济型光吸收酶标仪(TECAN);无菌厌氧箱(AW500TG,ELECTROTEK);低温高速离心机(Thermo Fisher);高速低温组织研磨机(武汉塞维尔生物科技有限公司);血糖仪(德国罗氏卓越精采型)。

1.2实验方法

1.2.1糖尿病小鼠模型建立

经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准(批准号：2201457)后将SPF级体质量为(18±3) g的8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠饲养于贵州医科大学动物实验中心SPF级实验室，平均温度(22±2)℃,相对湿度45%～65%,饮用水采用无酶无菌水供小鼠饮用。适应性喂养1周后部分小鼠高脂高糖饮食，部分小鼠正常饮食，4周以后两组恢复正常饮食。高脂高糖饮食组腹腔注射STZ,造模前小鼠禁食不禁水8 h,连续腹腔注射3次剂量为30 mg/kg的STZ(溶于pH=4.5,0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液),隔3 d测血糖，连续两次FBG>11.1 mmol/L认定为糖尿病小鼠模型成功。若FBG小于参照值，继续禁食后腹腔注射2次，最终FBG未符合参照值者未纳入实验。

1.2.2 P.g培养及计数

将P.g接种于BHI固体培养基中(添加5 mg/L氯化血红素、50μg/L维生素K1及无菌脱纤维羊血),36℃置厌氧箱培养2 d后接种于BHI液体培养基(添加同上),2 d后用使用紫外分光光度计进行活菌细胞计数，8000 r/min 10 min离心收集细菌，用PBS稀释细菌至终浓度为1×109 CFU/mL。

1.2.3实验分组

随机将正常饮食组分为两组：空白对照组灌饲PBS(WT组),另1组灌饲P.g混悬液(WT P.g组)。将糖尿病模型小鼠随机分成两组：STZ组灌饲PBS,STZ P.g组灌饲P.g混悬液。灌胃时长6周，隔日1次，每只小鼠灌胃每次200μL。自建模成功以来，1周1次检测体重，尾尖取血1周检测1次FBG。第12周后腹腔注射1.25%阿佛丁处死小鼠，收取距离小鼠末端盲肠段10 mm结肠组织。

1.2.4 ELISA法测定结肠GLP-1蛋白表达水平

取小鼠结肠0.1 mg置于1.5 mL无菌PBS,组织匀浆机裂解，3000 r/min 4℃离心10 min,取上清，使用GLP-1试剂盒应用双抗体夹心法对小鼠结肠组织进行检测。

1.2.5小鼠结肠组织形态学免疫荧光染色

将肠组织放入4%中性甲醛溶液中固定24 h后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，组织切片脱蜡，1∶40 GLP-1单克隆抗体孵育，PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶二抗，再次PBS冲洗后中性树胶封片，荧光显微镜观察肠组织状态并用扫片机扫描保存，经Aipathwell软件进行病理学图像分析。

1.2.6检测小鼠结肠PC1/3及proglucagon mRNA的表达

结肠样本用RNAstore样本保存液(DP408-02)处理-80℃保存，称取0.1 g结肠组织，低温高速组织研磨机进组织研磨，Trizol法提取RNA,超微光学分光光度计测量总RNA浓度。根据逆转录试剂盒，将提取的总RNA反转录成cDNA。GAPDH为内参基因，使用TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ进行qPCR检测，并计算PC1/3和proglucagon的相对表达，每个样本重复3次，所用引物见表1。

表1 q-PCR引物序列

1.2.7肠道微生物多样性测定

用无菌器械挑取结肠对应处的粪便500 mg置于液氮速冻1 h后-80℃保存。采用CTAB法对样本进行微生物组总DNA提取， 并通过2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，紫外分光光度计对DNA进行定量。使用DNA聚合酶进行PCR扩增，区域为16S rRNA基因的V4和V5区，引物为515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3),然后纯化(Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA,美国)、定量。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测后采用AMPure XT beads回收。对纯化后的PCR产物使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent,美国)和Illumina(Kapa Biosciences, Woburn, MA,美国)的文库定量试剂盒进行评估，使用NovaSeq 6000测序仪进行2×250 bp的双端测序。随后生物信息学分析：数据拆分-数据拼接和过滤-DADA2去噪，通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2进行长度过滤和去噪。获得ASV(feature)特征序列和ASV丰度表格，并去除singletons ASVs、多样性分析(基于得到的ASV进行α多样性分析和β多样性分析)-物种注释、相关性分析。

1.3统计学分析

数据采用SPSS 27.0进行数据分析和绘图，正态或近似正态分布的计量资料以x¯±s

表示，采用重复测量方差分析比较体重与血糖。单因素方差分析结肠组织GLP-1水平及小鼠结肠mRNA相关基因表达，组间两两比较用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 4组小鼠一般情况比较

WT组小鼠皮毛干燥浓密、活泼好动、饮食饮水正常。与WT组相比，模型组小鼠皮毛湿润油腻、体型消瘦、精神萎靡、嗜睡懒动、饮食饮水和小便明显增多，STZ P.g组更明显。正常对照组FBG水平维持在(5.79±1.26) mmol/L。图1a示，与WT组相比，WT P.g组FBG水平未见明显差异。模型组小鼠FBG水平明显升高(P<0.001),说明糖尿病小鼠模型建模成功。与STZ组相比，STZ P.g组在第12周时，血糖明显升高且具有统计学差异(P<0.05),说明P.g干预糖尿病小鼠后可能引起血糖波动。图1b显示：4组小鼠体重随时间变化有显著性差异(P<0.001)。STZ组第6周后体重开始明显降低，第9周有统计学差异(P<0.05)。STZ P.g组第7周体重下降明显且有统计学差异(P<0.05),第10周差异显著(P<0.01)。说明糖尿病组小鼠体重明显降低，灌饲P.g对糖尿病小鼠体重有影响。

图2结肠组织GLP-1蛋白免疫荧光染色图，其中红色为目的蛋白，蓝色为DAPI核染(×200)   

图1P.g分别对C57BL/6J糖尿病小鼠FBG(1a)及体重(1b)的影响

2.2结肠内GLP-1蛋白表达的比较

表2显示ELISA结果：与WT组相比，WT P.g组 、STZ组GLP-1表达量升高[(0.42±0.22)、(1.66±0.22) pmol/L],且STZ组差异有统计学意义(P<0.05);STZ P.g组表达量降低[(0.28±0.22) pmol/L]。与STZ组相比，STZ P.g组降低[(1.94±0.22) pmol/L]且具有显著性差异(P<0.05)。提示糖尿病小鼠结肠内GLP-1会应激性增高，P.g对正常小鼠无明显影响但对DM小鼠分泌GLP-1有明显的抑制作用。为进一步清晰直观地证明P.g对小鼠肠内分泌系统的影响，通过GLP-1抗体对小鼠肠组织进行免疫荧光染色发现：与STZ组相比，STZ P.g组结肠中阳性细胞比率显著减少(P<0.05),提示灌饲P.g可能引起肠组织中肠上皮细胞对GLP-1的表达(图2)。

表2P.g对C57BL/6J糖尿病小鼠结肠GLP-1蛋白表达的影响 

2.3小鼠结肠proglucagon及PC1/3 mRNA表达

经q-PCR检测结果(表3):与WT、STZ组相比，STZ P.g组proglucagon基因表达量明显下降且具有显著性差异(P<0.05)。对于PC1/3基因而言，与对照组相比，WT P.g、STZ和STZ P.g组显著性增高且差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3P.g对C57BL/6J糖尿病小鼠结肠GLP-1相关基因的表达 导出到EXCEL

Tab. 3 Effect of P.g on the expression of GLP-1 gene in colon of C57BL/6J diabetic mice x¯±s

2.4小鼠结肠肠道菌群分析

2.4.1 P.g及糖尿病改变肠道菌群组成(图3)

通过去重复以ASVs的概念构建类OTU,结果以韦恩图的形式反映了各组共有和特有的ASV数目。与WT组相比，WT P.g、STZ和STZ P.g组AVS丰富度降低。α多样性分析反应特定环境内的物种丰富度及均匀度。主要以Chao1来表示，指数越大，群落中包含物种的数目越多。与WT组相比，STZ P.g组Chao1指数显著下降。说明P.g可打破肠道菌群稳态，P.g会下调糖尿病小鼠肠道菌群丰度。β多样性分析指不同环境群落之间的物种差异性。主要通过主坐标分析PCoA来表示。横坐标组间距离越远，说明组间微生物组成结构差异越大。可以看出正常对照组与实验组相比差异显著，说明P.g和糖尿病一定程度改变了小鼠肠道菌群菌落结构。

2.4.2肠道微生物群群落组成分析

如图4所示，按门分类显示健康正常C57BL/6J小鼠肠道由62.5%Firmicutes、17.2%Bacteroidota、7.3%Patescibacteria、6.9%Actinobacteriota、2.5%Desulfobacterota组成。与WT组相比，WT P.g组Deferribacterota和Patescibacteria显著性降低且差异有统计学意义(P<0.05),Firmicutes和Desulfobacterota增加。STZ和STZ P.g组Firmicutes降低为51.22%、54.5%,Bacteroidota增高为28.33%、23.12%,Proteobacteria在STZ P.g组中显著性增加为11.5%,且差异有统计学意义(P<0.05)。按属水平上，STZ P.g组较WT组Aeromonas、Rothia、Paraprevotella、Clostridium显著性增加，Ligilactobacillus、Desulfovibrio、Akkermansia、Bacteroides、Lachnospiraceae显著性减少。RDA分析表示属水平top10的菌群与FBG、体重和GLP-1的关系。如图4c所示，箭头分别代表不同的影响因素，因素与样本之间的夹角为锐角时表示两个因素正相关，钝角时为负相关，射线越长，表明该因素的作用越大。可以看出在FBG与Lachnospiraceae_NK4A136_group、Enterorhabdus、Candidatus_Saccharimonas呈显著负相关，与Desulfovibrio、Akkermansia、Bacteroides明显正相关。(FBG中r2=0.50,P=0.003)

图3P.g及糖尿病对肠道菌群的影响 

图4肠道微生物群物种分析图  

3、讨论

牙周炎是一种由菌斑微生物引起的慢性炎症性疾病，当牙周支持组织遭到破坏后表现为牙龈出血、牙槽骨丧失、牙周袋的形成及牙齿松动[8]。牙周炎与糖尿病等非传染性疾病具有共同的危险因素，糖尿病增加牙周炎患病几率几乎已达成共识[9],但牙周炎对血糖控制也会产生负面影响。近年研究表明，患有重度牙周炎的孕妇存在更高妊娠糖尿病风险[10];慢性牙周炎合并2型糖尿病患者行牙周系统治疗后，血糖得到了更好地控制[11]。然而碍于遗传及环境因素，探究牙周炎对糖尿病的影响机制尚无确切定论。

牙周病对糖尿病的影响主要通过牙周袋-血循环及口腔-肠道轴方式[12]。随着宏基因组学和代谢组学的发展，肠道菌群对糖尿病的影响及作用逐渐受到众多学者关注，人们开始从一个新的角度看待牙周炎与糖尿病的关系。而口腔微生物群结构变化可能会影响肠道微生物结构紊乱，因此口腔微生物群被认为是连接牙周病与全身疾病的潜在机制[13]。本实验通过高脂饮食喂养4周后腹腔注射STZ构建糖尿病小鼠模型，并连续灌胃6周P.g,探究P.g对小鼠血糖的影响及可能机制。第6周时结果显示，STZ P.g组与单纯糖尿病组相比，血糖明显升高，这与Ohtsu等[14]的研究结论一致。并且FBG与Desulfovibrio、Akkermansia、Bacteroides呈明显正相关，说明牙周主要致病菌P.g可能参与血糖的调控。

Li等[15]发现牙周致病菌可通过干扰肠道菌群从而影响血糖，本研究发现灌胃P.g后结肠部位微生物群发生改变，细菌α多样性降低。当肠道微生物多样性降低后，微生物群可以进入血液循环，在局部和全身范围内引发炎症反应[16]。在门水平上，与正常对照组相比WT P.g组Firmicutes/Bacteroidota比值明显增加，这与Crusell等[17]的研究一致；STZ、STZ P.g组比值明显降低。细菌相关代谢物短链脂肪酸(SCFA)、三甲胺-N-氧化和胆汁酸等在炎症反应和组织破坏中具有重要作用：Akkermansia具有强抗炎作用，在P.g诱导牙周炎小鼠模型中，给予Akkermansia后显著减少P.g对不同体质量小鼠牙周组织的破坏[18]。Bacteroides、Lachnospiraceae可促使SCFA产生，SCFA对维持葡萄糖稳态具有重要作用[19]。Clostridia、Eubacterium参与初级胆汁酸向次级胆汁酸的转化，胆汁酸的顺利转化对黏膜屏障具有保护作用[20]。然而，上述菌种在STZ P.g组中显著性降低。Rotha是一种影响免疫功能低下的宿主的机会性病原体，在本实验中显著性增加。这些菌种的变化可能导致肠道屏障损伤，诱发肠道炎症。

肠内微生物群发生改变可调节GLP-1血清水平最终调节葡萄糖代谢[21]。GLP-1是一种重要的肠促胰岛素，由回肠末端、结肠和直肠的肠L细胞受外界食物营养刺激分泌，可影响胰岛功能、食欲、炎症、心血管病等[22]。在结肠中前体蛋白proglucagon经PC1/3剪切生成最终产物GLP-1[23]。 本研究发现P.g组和STZ组可刺激proglucagon及PC1/3 mRNA高表达，最终导致肠道中GLP-1蛋白增加。然而有研究表明糖尿病模型结肠及血浆GLP-1表达抑制[24,25],不一致原因可能为组织部位、肠道内环境如电解质及酸碱度、造模方式如给药剂量、药物及鼠种批次等所导致。本研究中STZ P.g组proglucagon表达明显下调，GLP-1蛋白水平降低。王娇等[26]研究发现脂多糖作为P.g最主要的毒性因子可诱导miR-425-5p靶向PTEN,上调顺式作用元件β-catenin,最终促进GLP-1的表达，但随着脂多糖浓度增加，miR-425-5p表达增加，细胞活力降低凋亡，GLP-1表达降低。因此单纯灌胃P.g或腹腔注射STZ时，GLP-1表达增加，当两种因素同时干扰时，GLP-1表达降低。

综上所述，P.g可影响糖尿病小鼠血糖水平，使血糖升高，机制可能为灌饲P.g改变了结肠门和属水平的肠道微生物组谱后，使GLP-1下调，从而干扰全身血糖。考虑动物伦理、样本丢失率及种属差异，更系统的机制需在大量临床样本中得到证实。

参考文献:

[12]李丽丽,谢晓婷,吴贇,等.牙周炎与糖尿病关联机制的研究进展[J].四川大学学报:医学版,2023,54(1):71-76.

[24]穆国华,赵宗江,蒋里,等.黄连-肉桂对db/db小鼠肠道菌群及内毒素影响的研究[J].现代中西医结合杂志,2021,30(13):1369-1374.

[26]王娇,韦丽瑞,黄凤姣,等.miR-425-5p对脂多糖诱导的肠道L细胞GLP-1分泌的影响及机制研究[J].中华内分泌代谢杂志,2021,37(7):646-652.

基金资助:国家自然基金项目(编号:81970939);贵州省卫生健康委项目(编号:gzwkj2023-61);

文章来源:陈文文,闫福华,莫朝伦等.牙龈卟啉单胞菌通过干扰肠道菌群对糖尿病小鼠血糖的影响[J].口腔医学研究,2023,39(11):1005-1011.