首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 糖尿病论文 > 桦褐孔菌黄酮对糖尿病肾病小鼠的治疗作用研究

桦褐孔菌黄酮对糖尿病肾病小鼠的治疗作用研究

2024-01-18 143 上传者：管理员

摘要：目的：研究桦褐孔菌黄酮对糖尿病肾病小鼠的治疗作用。方法：取50只4周龄C57BL/6小鼠，随机抽取6只为正常对照组，其余小鼠以链脲佐菌素(STZ)联合高糖、高脂饲料喂养9周，建立糖尿病肾病模型，建模成功后取30只随机分为模型组、阳性对照组(缬沙坦20 mg/kg)和桦褐孔菌黄酮低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)剂量组，每组6只。连续灌胃给药6周，6周后，观察小鼠免疫功能的变化。结果：与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠中骨髓来源的树突状细胞及其上清液中分泌的外泌体表面MHC-Ⅱ、CD86、CD54与CD80等分子的表达均显著降低(P<0.01),脾中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及其分泌的IFN-γ因子数量均减少(P<0.01)。经治疗后，各组小鼠细胞及外泌体表面分子MHC-Ⅱ、CD86、CD54、CD80的表达均明显升高(P<0.05,P<0.01),CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及IFN-γ的数量也不同程度增加(P<0.05,P<0.01)。结论：桦褐孔菌黄酮可以提高糖尿病肾病小鼠的免疫功能，对疾病有较好的治疗效果且安全性较高。

关键词：
免疫功能
并发症
桦褐孔菌
糖尿病
糖尿病肾病
黄酮
加入收藏

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是一种全身性的微血管并发症，是糖尿病发展过程中最易出现的并发症之一[1],高达50%的糖尿病人群会出现DN,以不断存在的蛋白尿和肾功能损害为特征，临床可出现水肿、少尿、腹水及高血压等症状，是导致终末期肾病的原因之一，严重降低了患者的生活质量，影响预后[2,3,4]。在治疗方面，为降低药物对肾脏的进一步损害，会产生很多用药限制。中医药在糖尿病肾病的治疗方面有其独特的方法，不仅可以有效地改善各种症状，还可降低副作用的产生，从而提高患者的生活水平[5]。桦褐孔菌是一类药食同源的真菌，在其应用过程中，人们不断挖掘其多种功效[6]。近年来，研究者逐渐开始重视其在肾病方面的应用，其中的多糖类成分已被证实可以很好地改善DN小鼠的生长状况[7]。因此，本研究进一步对其黄酮类成分进行探究，观察其对DN小鼠的治疗作用，从而为临床应用提供依据。

1、材料

1.1 动物

4周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0006。饲养环境湿度50%～60%,温度20～24 ℃,12 h交替照明，伦理编号：AEE2-2021-122。

1.2 试剂与药品

桦褐孔菌(特医食品研发中心有限公司);高糖高脂饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司);普通饲料(北京肝病研究所);血糖检测使用罗氏血糖仪；尿蛋白与尿糖检测使用优利特蛋白尿试纸与尿糖试纸；链脲佐菌素(STZ,sigma公司);缬沙坦(北京诺华制药有限公司);小鼠脏器组织淋巴细胞分离液试剂盒(索莱宝科技有限公司);Cytofix/Cytoperm TMPlus(破膜液，美国BD公司);小鼠MHC-Ⅱ APC、CD86 FITC、CD3 FITC、CD4 APC、IFN-γPE抗体均为美国BD公司；Mouse IL-4 Protein、Mouse GM-CSF Protein、Mouse TNF-α Protein均为美国RD公司。

1.3 主要仪器

超净工作台，北京王堂蓝翼科技有限公司；恒温二氧化碳培养箱，美国Thermo Scientific公司；生物安全柜，深圳亨睿生物科技有限公司；量化成像分析流式细胞仪，美国Luminex公司；FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司；倒置显微镜，OLYMPUS(日本);生物显微镜(全电动倒置荧光),Nikon(日本);多功能低温台式离心机，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司；超速离心机，贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。

2、方法

2.1 桦褐孔菌黄酮的提取

取野生桦褐孔菌，制成粉末后过60目筛，以60%的乙醇为提取剂，料液比1∶25 g/mL,在75 ℃下加热回流提取1 h, 收集上清液；重复4次，70 ℃下加热浓缩。提纯方法参考文献[8]。

2.2 造模及分组

C57BL/6雄性小鼠50只，标准环境中适应性饲养1周。实验造模依据相关文献[9,10,11],随机抽取6只为正常对照组(Ctrl),饲喂普通饲料，其余小鼠用高糖高脂饲料喂养4周，4周后禁食不禁水12 h, 腹腔注射60 mg/kg的链脲佐菌素溶液(STZ 溶解在0.1 mol/L、pH 4.5的柠檬酸缓冲液中，现配现用),正常组注射同体积的柠檬酸钠缓冲液；连续造模5 d, 禁食不禁水12 h, 取尾部静脉血检测空腹血糖(FBG)含量，连续3 d FBG≥12 mmol/L的小鼠视为糖尿病造模成功小鼠。糖尿病小鼠继续高糖高脂饮食4周，期间饮用5%葡萄糖水。4周后用尿蛋白试纸测尿蛋白，尿糖试纸检测尿糖，若连续3 d蛋白尿阳性，显示高尿糖则可视为DN模型造模成功，纳入正式实验。选取造模成功小鼠30只，随机分为模型组(DN)、阳性对照组(Positive)、桦褐孔菌黄酮低剂量(Low)、中剂量(Middle)、高剂量(High)组，每组6只，正常组饲喂普通饲料，其余组继续饲喂高糖高脂饲料。

2.3 给药

造模成功后，治疗组按相应药物剂量，溶解于200 μL去离子水中，超声波震荡溶解后灌胃给药，每日1次，模型组与正常对照组灌胃同体积的生理盐水，连续灌胃6周，观察小鼠的生长状态。

2.4 取材

2.4.1 小鼠骨髓细胞提取并诱导DC成熟(BMDC)

于超净台中取小鼠两股骨与胫骨，用1 640培养基冲洗骨髓腔，取骨髓细胞。将提取出的细胞用含终浓度为40 ng/mL的重组小鼠白介素4(IL-4)与40 ng/mL的重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、10%胎牛血清(FBS)的1 640培养基培养7 d诱导单核细胞转换为BMDC,第7天加入终浓度为20 ng/mL的肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激1 d使DC成熟。诱导方法参考相关文献[12]。待DC成熟后将其吹打至流式管中，冰上染色MHC-Ⅱ、CD86、CD54、CD80等抗体30 min, 使用量化成像分析流式细胞仪检测各分子的表达情况。

2.4.2 外泌体的提取

提取小鼠BMDC培养至第8天的上清液，分别以1 120 000 r/min, 10 min(取上清液);5 600 000 r/min, 30 min(取上清液);61 600 000 r/min, 70 min(取沉淀)的转速差速离心，最终提取的沉淀即为外泌体，染色同BMDC步骤。

2.4.3 提取脾脏淋巴细胞

取脾脏置于1 640培养基中，于生物安全柜中用70 μm滤网研磨过滤，用小鼠脏器组织淋巴细胞分离液将脾脏中淋巴细胞分离出，冰上染色CD3+、CD4+、CD8+等抗体30 min, 染色IFN-γ抗体需破膜30 min, 继续冰上染色30 min, 使用FACSCalibur流式细胞仪检测各分子的表达情况。

2.5 统计学处理

使用GraphPad Prism8.0.1软件进行数据统计，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1 小鼠建模前后血糖值

注射链脲佐菌素5 d后，禁食不禁水12 h, 取小鼠尾静脉血检测空腹血糖，与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠血糖值均升高，且差异有统计学意义(P<0.01),如表1所示，表明糖尿病小鼠模型造模成功。继续高糖高脂饮食加5%葡萄糖饮用水，4周后用尿蛋白试纸检测小鼠尿蛋白，试纸条连续3 d均为阳性(+),尿糖试纸检测呈强阳性(++++),表明DN模型造模成功。

表1 小鼠建模前后血糖值

3.2 小鼠BMDC表面分子的表达结果

实验结果显示，正常对照组小鼠的DC表面MHC-Ⅱ、CD86、CD54与CD80分子的表达明显高于其他组，而模型组小鼠表达最低，经过治疗后均有不同程度升高。与模型组相比，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),表明桦褐孔菌黄酮可以改善糖尿病肾病小鼠BMDC状态，如图1所示。

3.3 小鼠外泌体表面分子的表达

各组小鼠外泌体分子的表达与BMDC细胞表面的表达趋势相对一致，各治疗组相对于模型组均有不同程度升高(P<0.05,P<0.01),如图2所示。

3.4 小鼠T淋巴细胞的变化

实验发现，模型组小鼠脾脏中CD3+、CD4+、CD8+的T淋巴细胞数量明显减少，在经过治疗后有所上升，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。表明桦褐孔菌黄酮可以增加小鼠脾脏中T淋巴细胞数量，使小鼠体内免疫能力增强，有助于疾病的治疗，如图3所示。

图1 小鼠BMDC表面分子的表达情况

图2 小鼠外泌体表面分子的表达情况

图3 小鼠T淋巴细胞的变化

3.5 小鼠IFN-γ因子数量的变化

结果表明，CD4+淋巴细胞分泌的IFN-γ在治疗后均有不同程度的增加，且差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),如图4所示。

图4 小鼠CD4+T细胞中IFN-γ分泌水平

4、讨论

DN是糖尿病发展到后期引起的一种全身的代谢性疾病，临床上依据肾小球的病变程度，精准治疗所出现的症状[13]。在治疗方面，西医主要以控制血糖水平、降低血压、蛋白尿等水平阻止DN的进展，使用胰岛素、ACEI或ARB、他汀类等联合治疗，并在终末期进行血液透析甚至肾脏移植等方法，虽疗效显著同时也会出现许多不良反应，影响患者预后[14]。DN归属于中医“肾消”“水肿”“关格”等范畴，其病位在肾，与肝脾功能失调关系密切；病机以本虚标实为主。治疗上常辨证论治，消补结合，总体扶正祛邪，以生津养血、益气养阴、解毒消肿为主[5,15]。

桦褐孔菌是一种药食同源的真菌，早在16世纪，俄罗斯等地区就开始认识到它的疗效并在民间广泛应用[16]。中医典籍中有大量药食真菌的记载，如灵芝、冬虫夏草等，据张文彭教授考证[17],桦褐孔菌虽然也生长在黑龙江、长白山等地区，但中医药典籍中未见有明确记载，是被忽视的珍稀菌种。近年来，桦褐孔菌的研究逐渐掀起一股热潮，2014年，桦褐孔菌被央视以“来自俄罗斯的神奇宝贝”为名进行专栏报道；2019年，中国中医科学院张文彭教授以《桦褐孔菌研究与应用》为题进行了专题讲座，研讨会上，国医大师路志正与许润三两位老先生充分肯定了桦褐孔菌研究对于中医传承与创新的重要意义。同时人们也对其抗氧化、抗病毒甚至抗癌等功效进行了体内外的实验研究，发现其具有宝贵的研究前景[18]。在DN方面，相关研究也表明其多糖类成分有较好的保护肾脏的效果[7]。本次研究表明，将桦褐孔菌黄酮灌胃治疗小鼠后，小鼠的免疫功能均有不同程度的改善，其中以桦褐孔菌黄酮高剂量组效果最佳。

树突状细胞是目前已知的抗原提成能力最强的细胞，对于机体免疫起关键作用[19],MHC-Ⅱ、CD86、CD54、CD80等是DC表面特有的膜抗原，当DC成熟活化后表达升高；外泌体则是细胞内部释放出来的纳米级小囊泡，各种类型的细胞均可以释放外泌体，因其可以作为一种信号传导的载体，调节各种信号通路的顺利进行，近来对外泌体的研究已然成为一个热点[20]。BMDC来源的外泌体可以协同DC一起参与免疫应答，进而刺激机体的T细胞，而T细胞的激活是引起机体免疫应答的关键一步[21],T细胞进一步释放出IFN-γ因子，从而增强机体的免疫功能[22]。外泌体作为一种新兴的载体，其在信号传递方面的作用甚至要优于细胞，也是我们以后研究的重点。

本次动物实验主要研究DN小鼠治疗前后机体免疫功能的变化，通过检测BMDC、外泌体及T淋巴细胞等的功能变化，观察机体的免疫功能，从而验证桦褐孔菌黄酮对DN的治疗效果。本次实验结果也证实了桦褐孔菌黄酮类成分对糖尿病肾病小鼠的免疫功能有较好的改善作用，可为以后临床的进一步应用提供依据。

参考文献:

[8]张静,孙晶波,盛瑜,等.桦褐孔菌黄酮类化合物的提取工艺优化及抗氧化活性[J].食品工业科技,2018,39(12):171-176.

[10]冷昌龙,皮明山,龚晓康.单次大剂量对比多次小剂量STZ诱导C57BL/6J小鼠糖尿病肾病模型的研究[J].中国比较医学杂志,2021,31(9):113-118.

[16]黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌——桦褐孔菌[J].中国食用菌,2002,21(4):7-8.

[17]张文彭.桦褐孔菌中医作用特点分析[J].国际中医中药杂志,2019(7):776-780.

基金资助:山西省基础研究计划(202103021222013);

文章来源:刘超楠,周晓霜.桦褐孔菌黄酮对糖尿病肾病小鼠的治疗作用研究[J].中医药学报,2024,52(01):27-32.