心力衰竭(heart failure, HF)是各种心脏疾病终末期表现的一种复杂的临床综合征，已成为21世纪最为重要的心血管病症[1,2]。随着我国人口老龄化的加速，心力衰竭的发病率日渐上升，且病人生存率极低[3,4]。铁死亡是一种以铁依赖性为主要的非凋亡形式的细胞死亡，涉及铁代谢、氨基酸代谢和脂质代谢3个过程。研究表明，抑制心肌细胞的铁死亡可预防心血管疾病的发生，中药在治疗心力衰竭方面有一定优势[5],但目前针对铁死亡与心力衰竭的研究较少，仍有许多问题亟待解决，探究铁死亡的发生机制将为心力衰竭防治提供新的靶点。因此，本研究通过生物信息学从铁死亡角度分析治疗心力衰竭的靶点和通路，并筛选出相关中药，以期为心力衰竭的治疗提供新的思路和参考。

1、资料与方法

1.1 心力衰竭数据集收集及疾病靶点差异分析

通过GEO数据库检索与心力衰竭相关的数据集，以样本量大于50,同时包含正常样本以及疾病样本为筛选标准。将筛选得到的数据集矩阵进行规范化数据整理后，通过R软件的limma包对数据集中的靶点进行差异分析，设置错误发现率(FDR)<0.05及表达差异倍数(fold change, FC)>1,得到靶点差异分析火山图。

1.2 铁死亡相关靶点收集

通过FerrDb平台收集与铁死亡相关的靶点，包括铁死亡驱动因子、抑制因子、标记因子。

1.3 共同靶点的蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络

将收集得到的铁死亡相关靶点与差异分析得到的心力衰竭靶点取交集得到二者之间的共同靶点。将共同靶点导入STRING数据库,设置物种为“Homo sapiens”,得到与铁死亡相关的心力衰竭靶点间的PPI网络，并将其导入Cytoscape 3.9.1软件对该网络进行拓扑学性质分析。

1.4 共同靶点的基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析

将分析得到的共同靶点借助R软件进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以了解分析得到的靶标蛋白在信号通路中的作用，直观地得到铁死亡干预心力衰竭的可能途径。

1.5 治疗心力衰竭的天然药物成分和中药筛选

在HERB数据库检索共同靶点对应的天然药物成分和中药，并将检索得到的天然药物成分导入中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)数据库，筛选类药性(DL)≥0.18、口服生物利用度(OB)≥30%的天然药物成分。

1.6 分子对接

检索PDB数据库下载共同靶点的3D结构PDB格式，运用PyMOL软件和AutoDock软件对靶标蛋白质进行去水、加氢、原子类型定义、电荷计算等预处理后输出为pdbqt格式。在PubChem平台下载天然药物成分的2D结构，将其导入到Chem3D软件进行能量最小化，保存为mol2格式，再将mol2格式文件导入AutoDock Vina1.5.6软件加上电荷和非极性氢，保存为pdbqt格式文件，最后进行分子对接，并将对接结果导入PyMOL进行可视化处理。

2、结果

2.1 心力衰竭疾病靶点与铁死亡相关靶点收集

通过GEO数据库检索得到GSE57345和GSE120895数据集。GSE57345数据集包含样本量319例，标题为“RNA-SeqI dentifies novel myocardial gene expression signatures of heart failure”,该数据集包含疾病样本177例，正常对照样本136例。GSE120895数据集包含样本量55例，标题为“Correlation of clinical parameters of heart failure with my ocardial gene expression indilated cardiomyo pathy”,该数据集包含疾病样本8例，正常对照样本47例，其发表于2021年10月5日。将筛选出的数据集下载导出并进行数据的规范化处理后进行limma差异分析，共得到差异表达的靶点14 093个，见图1。通过FerrDb平台共收集到铁死亡相关靶点214个。

图1 疾病靶点差异表达分析   

2.2 靶点的PPI网络构建及拓扑学性质分析

将心力衰竭差异表达靶点与铁死亡相关靶点取交集得到共同靶点176个，见图2。将共同靶点导入STRING数据库得到PPI网络，详见图3,然后导入Cytoscape 3.9.1对该网络进行拓扑学性质的分析得到中介中心性(betweenness centrality)、接近中心性(closenesss centrality)、度值(Degree),通过2次筛选所有条件都大于中位值得到的核心靶点见表1,构建的核心网络结构图见图4。

图2 心力衰竭差异靶点与铁死亡靶点交集  

图3 共同靶点PPI网络图  

表1 拓扑学性质分析结果

图4 共同靶点拓扑分析图   

2.3 共同靶点的KEGG及GO富集分析

GO富集分析结果见图5,其中生物过程中对刺激的反应、代谢过程、生物调节等相关性较高；在细胞组分中，次级溶酶体、黑色素体、自噬体、线粒体外膜、基底质膜核等所占比例大；在分子功能中蛋白结合、铁离子结合、氧化还原酶活性影响相对靠前。KEGG通路富集分析结果见图6,主要与膀胱癌、脂质和动脉粥样硬化、叉头转录因子(FoXO)信号通路、晚期糖基化终产物及其受体(AGE-RAGE)信号通路等相关。

图5 GO富集分析   

图6 KEGG富集分析   

2.4 治疗心力衰竭的中药及天然药物成分筛选

借助HERB数据库，检索得到核心靶点的对应天然药物成分，并将得到的化合物导入TCMSP数据库，筛选得到满足DL≥0.18、OB≥30%条件的100余种天然药物成分以及中药80余种。详见表2。

2.5 关键靶点和天然药物成分的分子对接

将中药网络图拓扑分析得到的前5位核心靶点与其相关的前3位天然药物成分进行分子对接，得到的对接能量见表3。其中，原癌基因(JUN)与黄连素(berberine)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)14与醉茄素A(withaferin A)、MAPK3与血根碱(sanguinarine)结合较好。详见图7。

表2 共同靶点对应的天然药物成分和中药

图7 关键靶点分子对接图   

3、讨论

心力衰竭是由各种原因导致的心脏疾病的终末阶段，为当今社会常见的严重疾病，具有发病率高和死亡率高的特点。许多中药在治疗心力衰竭方面具有一定疗效，但具体有效成分和作用机制不明确。铁是人体多种生理活动所必需的微量元素之一，而铁的代谢平衡对人体生命活动至关重要[6]。铁死亡是一种铁依赖的脂质过氧化产物积累引发的细胞死亡[7],与细胞凋亡、程序性坏死等同属受调控的细胞死亡方式，参与多种疾病的发生、发展[8],多项研究发现铁的代谢与心力衰竭的发生、发展存在一定关系[9]。

本研究通过生物信息学分析筛选得到黄连、防己、黄柏、延胡索、牛膝、吴茱萸、黄芪、丹参等可能从铁死亡角度治疗心力衰竭前10位的靶点有抑癌基因(TP53)、JUN、MAPK14、泛素C(UBC)、MAPK3、信号转导与转录激活蛋白3(STAT3)、表皮生长因子受体(EGFR)、Harvery鼠肉瘤病毒癌基因(HRAS)、甾体激素受体共激活因子(SRC)、选择性自噬接头蛋白(SQSTM1),GO功能分析及KEGG通路富集分析发现与对化学应激的反应、对氧化应激的反应、次级溶酶体、黑色素体、自噬体、线粒体外膜、基底质膜核、氧化还原酶活性、铁离子结合、脂质和动脉粥样硬化、FoXO信号通路等相关。

TP53基因位于17号染色体上，编码蛋白对多种细胞的应激反应，调节靶基因的表达，从而诱导细胞凋亡、DNA修复或代谢改变，TP53活化后，诱导Bax转录，从胞浆转移到线粒体中，促进细胞色素C释放，导致细胞凋亡[10],而心肌细胞的凋亡和线粒体代谢异常都与心力衰竭的发生密切相关。Pipicz等[11]研究结果表明，在心肌细胞中STAT3可促进心肌分化、血管成分形成和细胞外基质稳态，且可保护心肌免受缺血/再灌注损伤，证明STAT3的表达对心力衰竭有改善作用。MAPK存在于人体大多数细胞内，参与细胞的分化、增殖、凋亡及炎症反应等多项活动，本研究结果也表明心力衰竭可能与MAPK3、MAPK14的表达异常有关。

通过关键靶点计算分析可得到天然药物成分有黄连素、醉茄素A、血根碱等，分子对接结果显示，JUN与黄连素、MAPK14与醉茄素A、MAPK3与血根碱结合较好。黄连素来源于黄连、防己、黄柏、延胡索、牛膝、吴茱萸等，曾志聪等[12]研究表明黄连素可提高慢性心力衰竭左室射血分数。何艳等[13,14]通过实验研究证明黄连素可通过抑制Toll样受体4(TLR4)信号传导减少心肌损伤，减少心力衰竭后并发症，抑制慢性心力衰竭炎性反应。于丁等[15]研究报道黄连素可通过增加心肌细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度，介导钙离子内流，增强心肌收缩力，发挥正性肌力作用而缓解心力衰竭。醉茄素A来源于醉茄，有调节免疫功能、抗氧化等功效，可通过促进自噬体与溶酶体融合，抑制由缺血/再灌注导致的自噬水平升高，缓解心肌组织损伤，从而改善心功能和心力衰竭症状[16]。郭蕊[17]研究结果表明醉茄素A可改善缺血/再灌注损伤后的心功能，缩小心肌坏死区域面积，并可活化Bcl-2、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抑制线粒体凋亡，降低心肌细胞凋亡率，发挥心脏保护作用。血根碱来源于砂仁、桑白皮、延胡索、元胡等，可通过抑制活性氧产生、活化血红素加氧酶-1(HO-1)/还原型辅酶氧化酶Ⅱ(NOX2)途径改善微循环，恢复心肌缺血病变区血流量；此外，血根碱还可通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路减轻心肌组织炎症反应，通过降低心肌组织中炎性因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达，减少缺血缺氧对心肌功能的损伤[18,19]。近年来，研究表明黄连、防己、延胡索等用于心力衰竭的治疗可获良效[20,21,22,23]。

本研究筛选得到的中药还可通过调节铁代谢、氨基酸代谢、脂质代谢过程减少铁死亡达到治疗心力衰竭的效果。铁是人体内必需的微量元素之一，参与氧输送、线粒体呼吸功能以及DNA的合成。廖君等[24]研究发现以黄芪为君药组成的脑泰方可以通过抑制铁调节蛋白Hepcidin分泌，促进膜转运蛋白Fpn表达，增加铁离子外排，减少细胞内铁聚集。健脾生血片中含有黄芪、茯苓等，李贵平等[25]研究发现健脾生血片可通过抑制铁调素高表达、增加铁利用， 提供足量铁元素，从而治疗慢性心力衰竭伴贫血。氨基酸是心肌能量代谢的底物之一，是氧化代谢生成三磷酸腺苷(ATP)的主要来源，氨基酸不仅可减轻心肌在缺血再灌注、心力衰竭和心肌梗死中的损伤，还有调节血脂、清除氧自由基的作用，可阻止缺血时的心肌损伤[26]。钟凌云等[27]研究发现黄连可调节大鼠氨基酸代谢。姬海南等[28]研究表明吴茱萸汤可调节大鼠氨基酸代谢、能量代谢及脂代谢等。脂质代谢异常会导致脂质过氧化和机体氧化应激反应，分泌多种促炎介质和生长因子，促进炎症反应和斑块的生长，进一步导致心脑血管动脉粥样硬化的发生发展，成为心力衰竭的高危因素之一[29]。心元胶囊中含有丹参等，景秀梅等[30]临床研究发现其可有效调节脂质代谢水平，改善心功能，缓解心力衰竭。芪苈强心胶囊主要由黄芪、丹参等组成，可提高脂肪酸转运及利用率，改善心肌能量代谢紊乱，治疗心力衰竭[31]。

本研究通过生物信息学分析得到了从铁死亡角度治疗心力衰竭的靶点、中药和天然药物成分。其结果在现有文献报道中均有相关研究证明，与心力衰竭的治疗有一定的关联性。但关于上述成分是否能明确成为治疗心力衰竭的天然药物成分及其发挥作用的具体机制，仍需要探究和证明。在临床试验中，中药成分复杂、作用靶点多、途径丰富，研究方向可能不明确。通过生物信息学对其关键成分、靶点进行探讨，则可使“药物-靶点-疾病”网络可视化，也为未来的研究指明了方向，在临床研究中具有一定意义。

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基金资助:国家自然科学基金项目(No.82174343);湖南省重点研发项目(No.2022SK2012); “一方”研究生创新项目(No.2023YF10);湖南省研究生创新项目(No.QL20230197);

文章来源:施敏,魏佳明,袁惠等.基于铁死亡角度治疗心力衰竭中药的筛选[J].中西医结合心脑血管病杂志,2024,22(02):193-200.