首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 2型糖尿病论文 > 运动训练对2型糖尿病小鼠生化指标及肾损害的影响机制研究

运动训练对2型糖尿病小鼠生化指标及肾损害的影响机制研究

2024-09-19 40 上传者：管理员

摘要：目的了解运动训练对2型糖尿病（T2DM）小鼠的体质量、血糖水平、糖化血红蛋白（HbA1c）、尿微量白蛋白等的影响，探讨运动训练基于转化生长因子-β（TGF-β）/Smad信号传导对因糖尿病所致肾损害的影响机制。方法将60只T2DM小鼠随机分为实验组与对照组（各30只），实验组小鼠进行为期8周的运动训练(10 m·min-1，每天60 min，每周5天)，对照组小鼠久坐不动。每4周检测两组小鼠体质量、血糖水平及上述生化指标。运动训练结束后将所有小鼠处死并检测其肾脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达，并进行苏木精-伊红染色和Masson染色观察肾脏组织变化。结果运动训练后实验组小鼠体质量、HbA1c、尿微量白蛋白、肝性脂肪酸结合蛋白水平均低于对照组（P<0.01），空腹血糖、进食后血糖水平两组间比较无明显差异（P>0.05）。实验组小鼠TGF-β1、Smad3蛋白表达低于对照组，Smad7蛋白表达高于对照组（P<0.01）。结论运动训练能控制T2DM小鼠的体质量，对保护肝肾功能有积极影响，有利于减轻T2DM所致肾损害。

关键词：
2型糖尿病
TGF-β/Smad信号通路
生化指标
糖尿病肾损害
运动训练
加入收藏

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）属于非胰岛素依赖型糖尿病，为一种常见的慢性代谢性疾病，已成为严重的公共卫生挑战之一[1-2]。近年来，T2DM发病率呈逐年上升趋势，且呈现年轻化的特点，该病严重影响患者的生活质量及寿命。据世界卫生组织（World Health Organization,WHO)[3]统计，仅2019年，糖尿病就造成全球200万人死亡。T2DM不仅与遗传、环境等因素有关，亦与生活方式的变化有关，如高脂高糖饮食和缺乏体育锻炼等[4]。

T2DM不仅会引发高血糖和胰岛素抵抗，还可能对多个器官和系统造成严重影响，其中尤以肾脏受损为甚，可引发糖尿病肾病并发症，进而导致肾功能不全甚至衰竭。T2DM所致肾损害，不仅在糖尿病患者中具有高发性，而且是慢性肾脏疾病的主要病因之一[5]。因此，要更好地了解T2DM引发的肾损害机制，并寻求有效的干预方法。

运动训练作为学者及专家主要推荐的非药物治疗手段，近年来备受研究关注。运动训练可增加心血管耐力、改善代谢功能等，被认为可能对T2DM患者的肾脏保护发挥积极作用[6]。研究将以运动训练为切入点，着重探究运动训练对T2DM患者肾脏保护的潜在作用及其作用机制，通过实验研究分析运动训练对体质量、生化指标、肾脏转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1）、Smad3、Smad7蛋白表达等方面的影响，旨在为T2DM的防治提供新的思路和策略。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验均按照实验室动物护理原则进行。实验小鼠选用品系为C57BL/6J，以高糖高脂饮食联合低剂量腹腔注射链脲佐菌素构建的T2DM小鼠模型[购自赛业（苏州）生物科技有限公司，产品编号SN0192442]，小鼠空腹血糖浓度达到11 mmol·L-1为成模标准。实验期间所有小鼠处于温度为（23±1）℃的房间内，保持12 h光/暗循环，可自由饮水和进食。研究经焦作市第二人民医院医学伦理审查委员会审核批准（编号KY2023-02-100）。1.1.2检测设备血糖仪及试纸（厂家：上海寰熙医疗器械有限公司，型号ACCU-CHEK Advantage）；全自动糖化血红蛋白分析仪（厂家：深圳市雷诺华科技实业有限公司，型号LD-560）；小鼠尿微量白蛋白测定酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（厂家：上海研尊生物科技有限公司，货号YZ-P63789）；小鼠肝脏型脂肪酸结合蛋白（liver type fatty acid binding protein,L-FABP）试剂盒（厂家：上海研尊生物科技有限公司，货号YZ-P64000）。电泳仪电源、电泳槽、转膜仪（厂家：美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验方案

将T2DM小鼠（10周龄）[7]随机分为实验组和对照组，每组各30只。对照组小鼠无运动安排，可久坐不动；实验组小鼠需使用跑台（跑步机）进行2周的适应性训练（适应期），之后进行实验，开展为期8周的运动训练（10 m·min-1，每天60 min，每周5天）[8]。小鼠在跑步机上的运动强度相当于最大耗氧量的50%～60%[9]。

实验期间所有小鼠均保持60%脂肪供能高脂饲料饮食。实验结束后所有小鼠经腹腔麻醉后处死，取肾脏等组织进行苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin stain,HE染色）和Masson三色染色法（Masson's trichrome stain,Masson染色）观察其肾脏组织变化情况。

1.2.2 生化指标检测

实验开始后每4周检测两组小鼠的体质量及各种生化指标：空腹血糖、进食后血糖水平采用尾尖采血后使用血糖仪测定；采血后使用全自动糖化血红蛋白分析仪对糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）进行测定；对尿微量白蛋白水平使用ELISA试剂盒测定，L-FABP水平使用L-FABP试剂盒测定。所有操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.3 肾脏组织蛋白表达检测

采用蛋白质印迹检测小鼠肾脏组织蛋白表达。将小鼠肾脏样本剪碎后放入离心管中，以肾脏∶裂解液=1∶7.5的比例加入裂解液，加入苯甲磺酰氟后粉碎并裂解，置于离心机中以4℃、12 000 rpm离心10 min，取上清液。通过BCA法对目标蛋白进行含量测定，通过制胶、上样、电泳、转模、封闭、孵育抗体、显影、定影，获得相应的清晰图像，使用Image J软件分析各个条带上的目标蛋白灰度值，测得该目标蛋白的积分光密度值，计算得出样本TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白浓度。

1.2.4 HE染色

将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色。酸水及氨水中分色，流水冲洗1 h后放入蒸馏水片刻，置入70%和90%酒精中脱水各10 min。加入酒精伊红染色液染色2～3 min。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯脱蜡。将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。染色结果中，细胞核呈蓝色，细胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈红色。

1.2.5 Masson染色

石蜡切片脱蜡至水，铬化处理，依次用自来水和蒸馏水洗。使用Weigert氏铁苏木精染5 min，充分水洗，如过染则使用盐酸酒精分化。蒸馏水洗后使用丽春红酸性品红液染5 min，蒸馏水快速漂洗。磷钼酸水溶液处理3～5 min。用苯胺蓝液复染5 min,1%冰醋酸处理1 min,95%酒精、无水酒精脱水、二甲苯脱蜡、中性树胶封固。染色结果中，胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。

1.2.6 统计学方法

将收集的信息数据直接导入Excel2010并建立数据库，进行数据存储和管理，利用SPSS 22.0软件（IBM SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）进行统计分析，计数资料以百分率（%）表示，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间单因素比较采用ANOVA方差分析。采用双侧检验（检验水准α=0.05），以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 不同时点两组小鼠体质量比较

分组时及运动训练4周、8周末，两组小鼠体质量组内比较差异均有统计学意义（P<0.01）；分组时实验组与对照组小鼠体质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；运动训练4周、8周末实验组小鼠体质量低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 不同时点两组小鼠体质量比较（g)

2.2 不同时点两组小鼠生化指标比较

分组时两组小鼠各项生化指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；运动训练4周、8周末，实验组与对照组小鼠HbA1c、尿微量白蛋白、L-FABP水平比较差异有统计学意义（P<0.01），而空腹血糖、进食后血糖水平比较,差异无统计学意义（P>0.05）。组内比较，分组时及运动训练4周、8周末，实验组小鼠HbA1c、尿微量白蛋白、L-FABP水平比较,差异均有统计学意义（P<0.05或0.01），空腹血糖、进食后血糖水平比较,差异均无统计学意义（P>0.05），对照组小鼠上述生化指标比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 不同时点两组小鼠生化指标比较

2.3 肾脏组织学实验

2.3.1 HE染色

从实验组与对照组小鼠肾脏组织的形态结构看，两组被膜均较完整，皮质与髓质分界清晰，肾小球和髓质集合管结构正常；两组均存在一定程度的间质炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主。其不同点主要为：实验组小鼠未见结缔组织增生和炎性渗出，未出现少量肾小管上皮细胞胞质空泡化。实验组（左）与对照组（右）小鼠肾脏组织形态结构CHE染色情况见图1。

图1 实验组（左）与对照组（右）小鼠肾脏组织形态结构（HE染色）

2.3.2 Masson染色

两组小鼠肾脏均可见不同程度的纤维化，对照组小鼠肾脏纤维表达高于实验组。实验组（左）与对照组（右）小鼠肾脏组织形态结构Masson染色情况见图2。

图2 实验组（左）与对照组（右）小鼠肾脏组织形态结构（Masson染色）

2.4 实验组与对照组小鼠肾脏蛋白表达比较

实验组小鼠TGF-β1、Smad3蛋白表达低于对照组，Smad7蛋白表达高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表3。

表3 实验组与对照组小鼠肾脏蛋白表达比较

3、讨论

运动是机体除基础代谢外最主要的耗能形式之一，可通过增加机体代谢率和胰岛素活性，使骨骼肌、脂肪增强对葡萄糖和游离脂肪酸的吸收、利用以增加供能[10-11]，长期规律的运动训练可增加骨骼肌对血糖的利用，减少血糖对胰岛素的依赖，降低血糖水平。研究发现，运动训练后实验组小鼠与久坐不动的对照组小鼠在相同时间节点（运动训练4周、8周末）体质量及HbA1c、L-FABP水平存在显著差异，且HbA1c、L-FABP水平均较分组时有所降低。而HbA1c是评估长期血糖控制情况的重要指标，其水平的降低反映了平均血糖水平的改善。这表明运动训练有效改善了T2DM小鼠的血糖控制情况。这一结果可能是由于运动训练增强了胰岛素敏感性，促进了机体对葡萄糖的摄取和利用，以及增加了脂肪组织的代谢活动，从而实现了血糖水平的有效控制。这与先前的研究一致，证明了运动训练在糖尿病管理中的关键作用[12]。

尿微量白蛋白是早期糖尿病肾病的标志物，其水平降低表明运动训练对糖尿病小鼠的肾功能具有保护作用。运动训练后，实验组小鼠尿微量白蛋白水平低于对照组（P<0.01），表明运动训练可能通过改善血管功能以及降低血糖水平来减轻肾脏负担，进而减少尿微量白蛋白的排泄，这与龚云等[13]的研究结论相似。这一发现进一步支持了运动作为糖尿病肾病预防和管理策略的重要性[14]。

L-FABP是肝细胞损伤和脂质代谢异常的标志物，其水平的降低反映了肝功能的改善。研究结果显示，运动训练降低了T2DM小鼠的L-FABP水平，表明运动训练有助于改善肝功能和脂质代谢。分析原因为，运动训练可能通过增强肝脏的脂质代谢能力，减少脂肪在肝脏中的堆积，减轻肝细胞的氧化应激和炎症反应，从而实现L-FABP水平的降低。这与其他研究一致，表明运动对肝脏健康的积极影响[15]。

TGF-β1、Smad3和Smad7是肾脏中关键的信号通路蛋白，它们在调控细胞增殖、分化、凋亡以及胶原合成等多种生物学过程中发挥重要作用[16]。在肾脏中，它们也参与了许多生理和病理过程，包括肾脏发育、纤维化、炎症反应以及肾损害的修复[17]。TGF-β1高表达与肾脏病变的进展和纤维化过程相关。Smad3是TGF-β信号通路的重要组成部分，在肾脏中参与调控细胞增殖、分化和纤维化等过程。Smad7在肾脏中起到负调控TGF-β信号通路的作用，它能够抑制Smad3的激活，从而减轻TGF-β信号通路的活性[18]。对蛋白表达进一步分析表明，实验组小鼠TGF-β1和Smad3蛋白表达较对照组降低，Smad7蛋白表达较对照组增加。而TGF-β1和Smad蛋白家族在调控肾脏纤维化过程中具有重要作用，提示运动训练可能通过影响这些信号通路，实现对肾脏的保护效果。

综上所述，运动训练能控制T2DM小鼠的体质量，且对保护肝肾功能有积极影响，尽管运动训练并未显著影响血糖水平，但其对HbA1c和L-FABP的调节表明了其在改善血糖水平与脂质代谢方面的潜力，有利于促进机体整体代谢平衡，从而降低糖尿病相关并发症发生的风险。此外，运动训练通过调节TGF-β/Smad信号通路的活性，可能在减轻肾脏纤维化、降低尿微量白蛋白排泄方面发挥了重要作用[19-21]。这一研究为深入理解运动训练在T2DM患者中的肾脏保护机制提供了新的线索，为运动训练作为一种非药物干预手段的临床应用奠定了基础。但研究仍存在实验时长有限的局限性，未来还应开展更多研究，以探索更详尽的分子机制和长期效果。

参考文献:

[1]包恩义,徐凤梅,赵秋波.α-硫辛酸联合丹参多酚酸盐治疗糖尿病周围神经病变临床疗效及对患者血清sICAM-1 Hcy水平的影响[J].临床心身疾病杂志,2022,28(1):107-109,116.

[2]中华医学会临床药学分会.2型糖尿病合并慢性肾脏病患者多重用药安全中国专家共识[J].中国全科医学,2022,25(23):2 819-2 835.

[4]钟鑫,戴霞,马翠,等.广西南宁市壮族居民饮食习惯与2型糖尿病患病风险的研究[J].中国医药导报,2020,17(27):12-15.

[5]李志平,刘敏洁,薛现军,等.血清C肽及β2-微球蛋白与2型糖尿病肾病发生风险相关性分析[J].临床心身疾病杂志,2020,26(4):149-151.

[7]王雪,呼永河.糖尿病小鼠模型的常见种类及其构建要素分析[J].实验动物与比较医学,2023,43(4):415-421.

[10]阳静,朱翠凤.肌肉减少症的营养与运动干预研究进展[J].肿瘤代谢与营养电子杂志,2020,7(4):502-505.

[11]李政委.有氧运动对2型糖尿病小鼠肾脏TGF-β1､Smad3､Smad7表达的影响[D].成都:成都体育学院,2021.

[12]陈玉轩,梁金梅,敖河边,等.间歇式高强度运动训练管理在2型糖尿病患者中的应用[J].中国临床护理,2022,14(7):420-421,425.

[13]龚云,李敏.有氧运动对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用[J].中国体育科技,2021,57(2):44-48.

[14]戴刘宴,张梅.运动干预糖尿病肾病的机制及应用研究进展[J].南京医科大学学报(自然科学版),2023,43(9):1 307-1 312.

[15]黄乔木,何艳.尿视黄醇结合蛋白､尿肝型脂肪酸结合蛋白､血成纤维细胞生长因子-21､血转化生长因子-β联合诊断早期糖尿病肾病的价值[J].临床肾脏病杂志,2022,22(4):283-290.