2型糖尿病肝损伤是一种以在2型糖尿病发展及治疗过程中出现的肝组织学或肝功能异常为临床特征的慢性并发症。近年来，随着2型糖尿病发病率急剧升高，2型糖尿病肝损伤发病率也呈现逐年上升的趋势[1]。肝脏为人体重要代谢器官，糖尿病发生过程中的糖脂代谢紊乱使得糖原及脂肪在肝脏内过度蓄积，引起肝损伤，而肝脏受损又进一步加重糖脂代谢紊乱，加速糖尿病的发展恶化，二者相互影响，导致恶性循环。2型糖尿病肝损伤最常见的是脂肪肝，严重时可导致肝纤维化、肝硬化、肝功能衰竭，其晚期死亡率已高于心血管疾病[2]。目前2型糖尿病肝损伤尚无特异性治疗药物，临床以对症治疗为主，寻求安全有效的治疗药物具有重要的现实意义。

藏药绿萝花是瑞香科结香属植物滇结香Edgeworthia gardneri Meissn的干燥花蕾[3]，在我国藏区常用于糖尿病、高血脂等疾病的预防治疗[4,5]。滇结香花蕾在汉族民间则常作为“密蒙花”使用，具有养肝明目之功效[6,7]。本课题组前期研究发现，绿萝花D101大孔树脂60%乙醇洗脱部位（以下简称D60）具有显著保肝活性[8]，其中多个单体能显著激活降糖保肝重要靶点——过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)[9]。故本研究拟基于2型糖尿病肝损伤大鼠模型探讨D60抗2型糖尿病肝损伤的作用及机制，以期为藏药绿萝花资源的开发利用提供参考。

1、材料与方法

1.1动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只，4周龄，体质量（160±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物质量合格证号：430727211100863273，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物使用许可证号：SYXK（赣）2017-0004。动物在通风良好、安静的环境下分笼饲养，相对湿度为40%～70%，温度为20～25℃。本实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审批，批文号：JZLLSC2021-0430。

1.2药物及试剂

绿萝花，购于杭州聚修堂健康科技有限公司，批号：6971422095186，经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为瑞香科结香属植物滇结香Edgeworthia gardneri Meissn的干燥花蕾，样品（编号：2020-EDG）保存于江西中医药大学中药资源与民族药研究中心。链脲佐菌素（STZ），购于上海麦克林公司，批号：C12542832；谷丙转氨酶（ALT）试剂盒（货号：C009-1）、谷草转氨酶（AST）试剂盒（货号：C010-1）、总胆固醇（TC）试剂盒（货号：A111-1）、甘油三酯（TG）试剂盒（货号：A110-1）、总胆汁酸（TBA）试剂盒（货号：E003）、总胆红素（TBIL）试剂盒（货号：C019-1），均购自南京建成生物工程研究所；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体（货号：AF6422）、p-AMPK抗体（货号：AF3422）、PPAR-γ抗体（货号：AF6284）、核转录因子κB(NF-κB）抗体（货号：AF0874-50）、p-NF-κB抗体（货号：AF2006）、β-actin抗体（货号：T0022），均购自美国Affinity Biosciences Technology公司。

1.3主要仪器

R-210型旋蒸仪，瑞士步琪公司；Neofuge 13R型高速冷冻离心机，瑞士Heal Force公司；MultiskanFC型全波长酶标仪，美国Thermo Fisher公司；580型血糖仪，江苏鱼跃医疗设备公司；PowerPac Basic型电泳仪、XRS+型凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；Elipseci-s型显微镜，日本Nikon公司；HI1210型捞片机、HistoCore Arcadia C型轮转石蜡切片机、TP1020-1型包埋机，德国Leica公司。

1.4绿萝花有效部位的制备

取绿萝花药材4.8 kg，加70%乙醇加热回流3次，每次1.5 h；提取液减压浓缩得总浸膏（1 112.64 g），总浸膏以石油醚萃取得石油醚部位（79.68 g）及水部位（984.96 g）。水部位以水分散至无明显颗粒，经D101大孔树脂梯度洗脱（水∶乙醇=100∶0→10∶90）；得水部位（733.44 g）、大孔树脂30%乙醇洗脱部位（135.36 g）、大孔树脂60%乙醇洗脱部位（D60,53.76 g）和大孔树脂90%乙醇洗脱部位（31.68 g）；将D60置于4℃冰箱保存备用。

1.5 2型糖尿病肝损伤大鼠模型复制

SD大鼠适应性饲养7 d后，随机选取10只作为正常组，给予标准饲料；剩余大鼠作为造模组，给予高糖高脂饲料（65%维持饲料+10%猪油+15%糖+5%奶粉+5%蛋黄粉）。饲养28d后，禁食12h，然后一次性腹腔注射35mg·kg-1STZ（以pH=4.2的柠檬酸缓冲溶液配制）；正常对照组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后，动物禁食不禁水12 h，尾尖取血，用血糖仪测定空腹血糖（FBG）值；若FBG≥16.7 mmol·L-1，且出现多饮、多食、多尿等症状，则视为2型糖尿病大鼠造模成功[10]，并继续以高糖高脂饲料喂养42 d，复制

2型糖尿病肝损伤模型。

1.6分组及给药

将造模成功的2型糖尿病大鼠随机分为4组，分别为模型组、D60低剂量组（0.07g·kg-1）、D60中剂量组（0.14g·kg-1）和D60高剂量组（0.28g·kg-1），每组10只。正常组及模型组给予质量分数为0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液灌胃；D60组分别给予相应药物灌胃（10 mL·kg-1），给药剂量依据课题组前期研究[8]确定；每天18∶00灌胃1次，连续干预42 d。

1.7血糖及体质量测定

实验过程中，观察记录动物的毛色、精神状态等一般情况，在给药前后测定记录其体质量及FBG值。

1.8样本采集及处理

末次给药结束后，大鼠禁食不禁水，次日测定各组大鼠体质量及FBG值；然后麻醉大鼠，腹主动脉取血，以3 000 r·min-1（离心半径8 cm）离心15 min，取上清液，-80℃保存待用。随后及时收集肝脏标本，测量并记录肝质量，计算：肝质量指数=肝脏质量（g）/体质量（g）×100%；将肝组织样本分为2份，1份冻存于-80℃待用，另1份用4%多聚甲醛溶液固定备用。

1.9肝组织病理学观察

取出用4%多聚甲醛溶液固定的肝组织，石蜡包埋、切片（4μm），常规脱蜡、脱水，苏木精-伊红（HE）染色后，在光学显微镜下观察。

1.1 0血清生化指标检测

将冻存的血清样本于-20、4℃梯度解冻后，平衡到室温，严格按照试剂盒说明书步骤操作，测定血清ALT、AST、TC、TG、TBA及TBIL水平。

1.11 Western Blot法检测肝脏中AMPK/PPAR-γ/NF-κB通路蛋白表达

将肝组织称定质量后，加入3含有1%PMSF的RIPA裂解液，匀浆3次，每次10 min；以4℃、12 000 r·min-1(离心半径8 cm）离心15 min，取上清液；采用BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量。根据上清液体积加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，通过金属浴（100℃、10 min）使蛋白变性；经SDS-PAGE凝胶电泳（80 V、160 min）分离蛋白后，电转移（300 mA、90 min）至PVDF膜上；将PVDF膜转移至无蛋白快速封闭液中，在室温下封闭1 h；将蛋白条带分别置于对应的一抗（稀释比例为1∶1 000）中，4℃下孵育过夜，用1×TBST洗涤3次，每次15 min；然后再加入相应二抗（稀释比例为1∶10 000），室温下孵育2 h,1×TBST洗涤3次，每次15 min；采用化学发光法显影后，通过成像扫描分析系统保存图像。采用ImageJ软件对图像进行灰度值分析，以β-actin为内参，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值作为目的蛋白的相对表达水平。

1.12统计学处理方法

采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 D60对2型糖尿病肝损伤大鼠FBG值的影响

结果见表1。与正常组比较，模型组大鼠的FBG值显著升高（P<0.01）。与模型组比较，D60各剂量组大鼠的FBG值均显著降低（P<0.01）。结果表明，D60能改善2型糖尿病肝损伤大鼠的FBG水平。

表1绿萝花提取物（D60）对2型糖尿病肝损伤大鼠空腹血糖（FBG）值的影响（,n=10

2.2 D60对2型糖尿病肝损伤大鼠体质量及肝质量指数的影响

结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠的体质量显著降低（P<0.01），肝质量指数显著升高（P<0.01）。与模型组比较，D60各剂量组大鼠的体质量均显著升高（P<0.01),D60中、高剂量组大鼠的肝质量指数明显降低（P<0.05,P<0.01）。结果表明，D60能增加2型糖尿病肝损伤大鼠的体质量，并改善肝损伤状况。

表2绿萝花提取物（D60）对2型糖尿病肝损伤大鼠体质量及肝质量指数的影响（,n=10)

2.3 D60对2型糖尿病肝损伤大鼠肝组织病理变化的影响

结果见图1。正常组大鼠肝组织结构清晰，肝索排列整齐，未见异常。与正常组比较，模型组大鼠可见肝小叶结构破坏，出现细胞空泡、肝索排列紊乱、炎性细胞浸润等病理学改变。与模型组比较，D60各剂量组大鼠的肝小叶结构较完整，肝索排列趋于整齐，炎性细胞浸润有不同程度减轻。结果表明，D60能明显改善2型糖尿病肝损伤大鼠的肝组织病理变化。

图1绿萝花提取物（D60）对2型糖尿病肝损伤大鼠肝组织病理变化的影响（HE染色，×200)

2.4 D60对2型糖尿病肝损伤大鼠血清中肝损伤因子水平的影响

结果见表3。与正常组比较，模型组大鼠血清中TC、TG、ALT、AST、TBIL、TBA水平均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，D60各剂量组大鼠血清中的TC、TG、ALT、AST、TBIL、TBA水平均明显降低（P<0.05,P<0.01）。结果表明，D60能降低2型糖尿病肝损伤大鼠血清中的肝损伤因子水平。

表3绿萝花提取物（D60）对2型糖尿病肝损伤大鼠血清中肝损伤因子水平的影响（,n=10)

2.5 D60对2型糖尿病肝损伤大鼠肝组织中AMPK/PPAR-γ/NF-κB通路蛋白表达的影响

结果见图2。与正常组比较，模型组大鼠肝组织中PPAR-γ、p-AMPK/AMPK蛋白表达显著下调（P<0.01),p-NF-κB/NF-κB蛋白表达显著上调（P<0.01）。与模型组比较，D60各剂量组大鼠肝组织中p-AMPK/AMPK蛋白表达显著上调（P<0.05,P<0.01),p-NF-κB/NF-κB蛋白表达显著下调（P<0.01),D60中、高剂量组大鼠肝组织中PPAR-γ蛋白表达显著上调（P<0.01）。结果表明，D60可能通过调控AMPK/PPAR-γ/NF-κB通路来改善2型糖尿病大鼠的肝损伤。

图2绿萝花提取物（D60）对2型糖尿病肝损伤大鼠肝组织中AMPK/PPAR-γ/NF-κB通路蛋白表达的影响（,n=3)

3、讨论

高糖高脂饮食结合腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病大鼠肝损伤模型，能够模拟人类因高糖高脂高热量的生活习惯而自发形成2型糖尿病进而并发肝损伤的过程，是研究2型糖尿病肝损伤的理想动物模型[10]。因此，本实验采用高糖高脂持续喂养联合一次性腹腔注射35 mg·kg-1STZ建立2型糖尿病肝损伤大鼠模型。血清中的TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL水平能够一定程度上反映肝损伤的严重程度，是评价2型糖尿病肝损伤的重要指标[11]。本实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠的FBG值、肝质量指数及血清中TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL水平均显著升高，同时肝脏HE染色结果可见肝小叶结构破坏，出现细胞空泡、肝索排列紊乱、炎性细胞浸润等明显病理改变，表明2型糖尿病肝损伤大鼠造模成功。而与模型组比较，D60各剂量组大鼠的FBG值、肝质量指数及血清中TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL水平均明显降低，肝组织病理损伤有不同程度减轻，表明绿萝花D60部位可明显改善2型糖尿病大鼠的肝损伤。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是生物能量代谢调节的关键因子，在2型糖尿病及其肝肾并发症的发病机制和治疗过程中起至关重要的作用[12,13]。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）是核内受体转录因子超家族成员，有α、β、γ三种亚型[14]。作为AMPK的下游因子，PPAR-γ激活可增强胰岛素及其受体间的信号传导，提高胰岛素敏感性，达到降糖目的；还可增加肝脏脂联素表达，抑制炎症反应，从而延缓糖尿病肝损伤进程[15,16]。核转录因子κB(NF-κB）是炎症反应的启动因子，当机体受到高糖刺激时，肝脏NF-κB呈游离状态，启动调控炎症反应，加重胰岛素抵抗及肝脏炎症浸润。活化的PPAR-γ与NF-κB在组织中的表达呈负相关，通过抑制NF-κB活性可负向发挥调控炎症反应的作用[17,18]。本研究结果显示，与模型组比较，D60给药组大鼠肝组织中p-AMPK/AMPK、PPAR-γ蛋白表达显著上调，p-NF-κB/NF-κB蛋白表达显著下调。结果表明绿萝花D60部位可能是通过活化AMPK来激活其下游因子PPAR-γ，从而进一步抑制NF-κB表达，发挥改善2型糖尿病大鼠肝损伤的作用。

综上所述，藏药绿萝花的D101大孔树脂60%乙醇洗脱部位（D60）能够明显改善高糖高脂联合小剂量链脲佐菌素一次性腹腔注射诱导的2型糖尿病大鼠肝损伤，其机制可能与调控AMPK/PPAR-γ/NF-κB信号通路有关。

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基金资助:国家自然科学基金项目(82060758);江西省青年科学基金资助项目(20202BAB216037);江西省教育厅一般项目(GJJ190667);

文章来源:孙杰,徐文雅,刘方圆等.藏药绿萝花提取物对2型糖尿病肝损伤大鼠的影响及机制[J].中药新药与临床药理,2023,34(08):1041-1046