2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)占糖尿病患病人数的90%以上，已成为世界范围内主要的公共卫生问题，其特征是脂肪组织、骨骼肌和肝脏中的胰岛素分泌不足和全身胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)。胰岛素能通过调节肝脏、骨骼肌和脂肪组织中的葡萄糖和脂质代谢来调节代谢稳态，尽管T2DM的发病机制尚不完全清楚，但已有研究证明IR在T2DM的发病机制中起着核心作用[1]。胰岛素是维持葡萄糖稳态和调节碳水化合物、脂质及蛋白质代谢所必需的，与特定受体结合引发多种信号通路。胰岛素在体内的正常作用和分泌平衡被破坏，会使高血压、心血管疾病和癌症等风险增加[2]。现有技术手段主要是干预患者生活方式、口服降糖药物、注射胰岛素等，但无法避免由此产生的机体耐药和副作用，需要找到更有效的治疗策略[3]。

研究表明，miRNA是19～25个核苷酸的单链RNA,能与靶mRNA的互补区域，通过降解来稳定地停止翻译过程，影响细胞内广泛的生物过程[4]。据报道，miR-93-5p在糖尿病及并发症等许多疾病中发挥关键作用[5]。miR-93-5p在糖尿病肾病中调节细胞的增殖和转移过程，参与足细胞免疫过程，在转录后水平上调控蛋白质编码基 因的表达，从而影响疾病的病理生理过 程[6]。前期研究发现miR-93-5p通过靶向肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)促进胰岛素抵抗以调节HepG2细胞中的T2DM进展[7]。因此，本研究采用体外诱导肝癌HepG2细胞构建IR模型，进一步探究miR-93-5p对HepG2细胞增殖、自噬、葡萄糖抵抗以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路影响的机制研究，为T2DM的作用机制和治疗靶点提供理论基础。

1、材料与方法

1.1实验材料

MEM、胎牛血清(货号：c11095500bt、10270-106)购于美国Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、D-无水葡萄糖、CCK8、RIPA(强)组织细胞快速裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：T1350、G8150、CA1210、R0010、PC0020)购于北京索莱宝科技有限公司，葡萄糖检测试剂盒、糖原检测试剂盒(货号：F006-1-1、A043-1-1)购于南京建成工程研究所，3-MA(货号：HY-19312)购于美国MCE公司。PVDF转移膜、化学发光试剂(货号：IPVH00010、WBKLS0500)购于美国millipore公司，抗LC3-I、LC3-II、HGF、p-AKT、GAPDH抗体和羊抗兔IgG抗 体(货号：PAB47930、PAB47947、PAB30836、PAB30596、PAB36269、SAB43714)购于武汉bioswamp科技公司，抗AKT抗体(货号：Ab133458)购于美国abcam公司。

1.2实验器材

CO2恒温培养箱(型号：311)购于美国Thermo公司，倒置荧光显微镜(型号：DMIL LED)购于德国Leica公司，酶标分析仪(型号：AMR-100)购于杭州奥盛仪器有限公司，全自动化学发光分析仪(型号：Tanon-5200)购于上海天能仪器公司，电泳仪(型号：mini protean 3 cell)购于美国BIO-RAD公司。

1.3实验方法

1.3.1 HepG2细胞IR模型构建

用含10%胎牛血清的MEM培养基，于37℃、5%CO2培养箱培养HepG2细胞，1∶2传代。取对数生长期的细胞用含30 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h构建IR细胞模型，对照组用正常浓度的葡萄糖(5.5 mmol/L)培养基孵育48 h,然后用试剂盒检测葡萄糖消耗量和糖原合成量判断造模是否成功。

1.3.2葡萄糖消耗量检测

将HepG2细胞接种到有微孔板中，浓度为2×105个细胞/孔。细胞在高浓度葡萄糖溶液(30 mmol/L)中培养，汇合度达到80%汇合时，恢复到正常培养条件。随后，向培养基中加入100 nmol/L胰岛素，37℃下孵育15 min, 12 h后用葡萄糖比色检测试剂盒检测葡萄糖消耗量。葡萄糖消耗量=空白孔的葡萄糖浓度-含孔细胞的葡萄糖浓度。

1.3.3糖原合成检测

将对照组和模型组细胞在37℃下用100 nmol/L胰岛素处理15 min后，用裂解缓冲液裂解，离心取上清液接种到试剂盒的孔板中。随后，按照说明书分别加入工作试剂，室温孵育30 min。用酶标仪检测在570 nm波长处的光密度。绘制标准曲线计算糖原浓度。

1.3.4细胞转染

6孔板中细胞融合度为70%时进行转染，用Opti-MEM稀释miR-93-5p inhibitor、NC及Lipofectamine® RNAiMAX。混匀稀释后的miRNA和Lipofectamine® RNAiMAX,室温孵育后加到含有细胞和新鲜培养基的板孔中，于37℃、5%CO2培养箱中转染4 h后更换新鲜的培养基继续培养48 h,荧光显微镜拍照观察转染情况。

1.3.5细胞分组及处理

将细胞分为Control组、IR组、inhibitor NC组、inhibitor组及3-MA+inhibitor组。其中，Control组正常培养HepG2细胞；IR组用高浓度葡萄糖诱导HepG2细胞构建IR细胞模型；inhibitor NC组转染inhibitor NC质粒至IR细胞模型培养48 h; inhibitor组转染miR-93-5p inhibitor质粒至IR细胞模型培养48 h; 3-MA+inhibitor组先转染miR-93-5p inhibitor至IR细胞模型培养48 h,然后添加5 mmol/L的自噬抑制剂3-MA继续培养24 h。收集各组细胞，检测葡萄糖消耗量和糖原合成量。

1.3.6 CCK8检测各组细胞增殖活性

HepG2细胞加入96孔板中，每孔3×103个细胞，置于培养箱使细胞贴壁，按照方法1.3.5节进行分组处理，继续培养24 h后每孔加入10μL CCK8溶液。4 h后检测450 nm各孔吸光值。

1.3.7 Western-Blot检测各组细胞LC3-I、LC3-II、HGF、AKT和p-AKT的蛋白表达

用RIPA缓冲液溶解各组细胞，4℃下12 000 r/min离心10 min得到上清液，BAC试剂盒测定总蛋白。每孔上样量为20μg蛋白，然后用含12%分离胶的SDS-PAGE在120 V条件下电泳50 min分离，湿转转膜后，PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1 h,将PVDF膜与相应的一抗LC3-I(1∶1 000)、LC3-II(1∶1 000)、HGF(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)在4℃下孵育过夜。孵育后洗膜，用山羊抗兔二抗(1∶20 000)孵育2 h。取ECL发光液与孵育后的膜用全自动化学发光分析仪检测，并通过TANON GIS软件读取条带灰度值，以GAPDH为对照。

1.4统计学分析

所有数据至少进行三次重复实验，均以平均数±标准差

表示。多组间比较采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 IR模型鉴定

使用试剂盒检测高糖诱导后细胞的葡萄糖消耗和糖原合成情况，证明IR模型构建成功，结果见图1。与Control组相比，IR模型细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量均显著下降(P<0.05)。

图1 IR模型细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量检测 

2.2转染效率验证

使用Lipofectamine 2000作为载体将miR-93-5p inhibitor、NC转移至HepG2细胞系中，荧光拍照验证转染效率，结果见图2。miR-93-5p inhibitor组和miR-93-5p inhibitor NC组均呈现绿色荧光，Control组无荧光，表明miR-93-5p inhibitor、NC已成功转染。

图2荧光显微镜观察转染效率(×100)   

2.3 miR-93-5p inhibitor对各组细胞增殖活力的影响

CCK8法检测各组细胞增殖活力，结果见图3。与Control组相比，IR组细胞增殖活力显著下降(P<0.01)。与IR组和IR+inhibitor NC组相比，IR+inhibitor组细胞增殖活力显著增加(P<0.01)。与IR+inhibitor组相比，IR+3-MA+inhibitor组细胞增殖活力显著下降(P<0.01)。

2.4 miR-93-5p inhibitor对各组细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量的影响

葡萄糖比色检测试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗情况，糖原测定试剂盒检测各组细胞糖原合成情况，结果见图4。与Control组相比，IR组细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量显著下降(P<0.01)。与IR组和IR+inhibitor NC组相比，IR+inhibitor组葡萄糖消耗量和糖原合成量显著增加(P<0.01)。与IR+inhibitor组相比，IR+3-MA+inhibitor组葡萄糖消耗量和糖原合成量显著下降(P<0.01)。

图3 CCK8法检测各组细胞增殖活力变化  

图4试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量变化  

2.5 miR-93-5p inhibitor对各组细胞HGF、LC3-I、LC3-II、AKT和p-AKT蛋白表达的影响

Western-Blot检测各组细胞蛋白表达的变化，结果如图5所示。与Control组相比，IR组LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表 达均显著增加(P<0.01),HGF蛋白和LC3-II蛋白表达显著下降(P<0.01)。与IR组和IR+inhibitor NC组相比，IR+inhibitor组LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均显著下降(P<0.01),HGF蛋白和LC3-II蛋白表达显著增加(P<0.01)。与IR+inhibitor组相比，IR+3-MA+inhibitor组LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均显著增加(P<0.01),HGF蛋白和LC3-II蛋白表达显著下降(P<0.01)。

3、讨论

IR是T2DM的主要病理原因之一。胰岛素是调控体内血糖动态平衡的主要激素，通过激活介导肝糖原合成的糖原合酶来促进葡萄糖储存，肝脏是胰岛素作用的主要靶器官[8]。肝脏在糖代谢中发挥着重要作用，负责葡萄糖的形成和储存。机体摄入碳水化合物后，肝脏通过葡萄糖代谢促进葡萄糖合成到葡萄糖储存的快速转变[9]。而当肝脏出现IR会导致游离脂肪酸在肝细胞中积累，使肝脏对胰岛素的敏感性降低，血糖升高，细胞对葡萄糖摄取能力下降，血糖代谢失衡[10]。HepG2细胞被广泛用于体外模拟肝功能，与正常肝细胞具有相同的脂质和糖代谢[11]。有研究[12]使用IR诱导的HepG2细胞研究黄芩素对葡萄糖代谢和胰岛素信号通路的影响，结果表明，黄芩素能刺激葡萄糖消耗和乳酸释放，抑制野生型HepG2细胞中葡萄糖的产生。尽管有多种可以改善IR的抗糖尿病药物可供患者使用，但目前还没有专门批准用于治疗IR的药物。

图5 Western-Blot检测各组细胞HGF、LC3-I、LC3-II、AKT和p-AKT蛋白表达变化  

大量研究表明，miRNA在调节各种疾病(如癌症、神经退行性疾病和代谢性疾病)相关基因中具有十分重要的作用。LI的研究[13]中，miR-140-5p过表达诱导HepG2细胞中葡萄糖消耗和葡萄糖摄取受损，糖原合成酶表达被抑制，增强了IR作用。吴美芬[14]等发现在糖尿病大鼠中，沙格列汀治疗后miR-15a-5p表达上调，并能激活胰岛素转导提高机体对葡萄糖的利用率，缓解胰岛素抵抗。研究表明，miR-93-5p能负调节葡萄糖转运蛋白4的表达，平衡全身葡萄糖稳态，参与T2DM的发病机制。miR-93-5p是肝癌中异常表达的关键miRNA,在肝癌细胞中miR-93-5p上调并促进细胞增殖，并可能直接靶向HGF[7]。HGF是体内重要的调节因子，上调HGF表达能促进葡萄糖转运和利用[15]。本研究中，高糖诱导HepG2细胞后，细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量均明显下降，HGF蛋白表达下调，细胞增殖能力下降。而抑制miR-93-5p表达后，IR模型细胞葡萄糖消耗量和糖原合成量均明显增加，HGF蛋白表达上调，细胞增殖能力增强。这说明抑制miR-93-5p表达能缓解IR造成的细胞葡萄糖利用受损并增加对胰岛素的敏感性。

胰岛素与胰岛素受体结合促进胰岛素受体的自磷酸化，进而启动胰岛素信号转导[16]。胰岛素与受体的结合作用介导其主要底物IRS-1磷酸化，促进其与PI3K的p85调节亚基之间的关联作用，将PI3K上的催化亚基定位到膜上并激活，AKT被募集到质膜上，两个关键残基磷酸化[17]。反过来，磷酸化的AKT直接调节代谢步骤的底物的活性，参与糖原合成[18]。因此，胰岛素刺激的PI3K/AKT通路的激活在代谢稳态中起着核心作用，PI3K/AKT通路调节受损促进了IR相关代谢紊乱的发展。有研究[19]表明，PI3K/AKT轴蛋白表达水平受胰岛素信号影响，用肾上腺髓质素处理能增强PI3K/AKT通路信号的转导，改善肥胖大鼠的IR,有效恢复胰岛素的代谢调节作用。PI3K/AKT信号通路还与自噬的发生密切相关，有研究发现miR-93-5p通过PI3K/AKT通路影响细胞自噬[20]。本研究中，抑制miR-93-5p表达后，IR模型细胞中LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达被抑制，LC3-II蛋白表达增加，说明miR-93-5p通过调控AKT蛋白磷酸化影响IR细胞自噬。而在miR-93-5p inhibitor的基础上用3-MA干预后，miR-93-5p inhibitor的作用被逆转，进一步证明了miR-93-5p对PI3K/AKT通路和自噬的调控作用。

综上，miR-93-5p通过调控PI3K/AKT通路影响高糖诱导的HepG2细胞自噬及对体内葡萄糖的利用，改善肝脏IR,进而靶向治疗T2DM。

参考文献:

[2]刘福君,常李李,王为兰,等.肝脏胰岛素抵抗与2型糖尿病[J].中国医学科学院学报,2022,44(4):699-708.

[3]管琦,易恒炜,吕碧君,等.山药多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响及作用机制[J].食品科学技术学报,2023,41(3):64-71.

[6]顾勇,杨艳,李娜,等.miR-93-5p靶向DUSP8基因对糖尿病肾病足细胞损伤的影响[J].河北医学,2022,28(01):21-28.

[14]吴美芬,潘海燕,黄兴丽,等.沙格列汀通过miR-15a-5p/INSR轴缓解糖尿病大鼠胰岛素抵抗的机制研究[J].安徽医科大学学报,2021,56(7):1082-1088.

[15]黄好,贾虹,王晓霜,等.妊娠期糖尿病患者胎盘组织中miRNA-508-3p和HGF表达水平及其对滋养细胞胰岛素抵抗的影响[J].吉林大学学报(医学版),2021,47(1):187-195.

文章来源:周曼,曹萍,侯以琳,等.miR-93-5p通过PI3K/AKT通路调控HepG2细胞自噬[J].现代肿瘤医学,2024,32(16):2969-2974.