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南瓜多糖调控Nrf2/γ-GCS通路对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响

2024-09-18 29 上传者：管理员

摘要：目的：探讨南瓜多糖（PP）调控Nrf2/γ-GCS通路对缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞（H9C2）损伤的影响。方法：建立HR细胞模型，确定PP给药浓度，将H9C2细胞分为Control组、H/R组、南瓜多糖组（PP组，2 mg/L PP）、Nrf2抑制剂组（ML385组，2.0μmol/L ML385）、PP+ML385组（2.0 mg/L PP+2.0μmol/L ML385），分别检测H9C2细胞凋亡、线粒体膜电位变化、氧化应激（LDH、MDA、SOD、ROS）、炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）水平及Nrf2、γ-GCS蛋白表达。结果：与Control组比较，H/R组细胞形态发生变化，细胞损伤及线粒体膜电位下降，H9C2细胞活力、SOD及Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率、LDH、MDA、ROS及TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高（P<0.05）；与H/R组比较，PP组细胞损伤减轻，线粒体膜电位恢复，H9C2细胞活力、SOD及Nrf2、γ-GCS蛋白表达水平显著升高，细胞凋亡率、LDH、MDA、ROS及TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低（P<0.05），而ML385与PP作用效果相反，ML385可逆转PP的抗氧化、抗炎作用。结论：PP上调Nrf2/γ-GCS通路发挥抗氧化、抗炎作用，减轻H/R诱导的H9C2细胞损伤。

关键词：
Nrf2/γ-GCS通路
PP
南瓜多糖
心肌细胞损伤
缺氧/复氧
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心肌缺血再灌注损伤是缺血性心肌病等多种心血管疾病病理过程，缺氧可引起心肌细胞凋亡，复氧时可产生氧化应激，加重心肌损伤，研究表明，中药活性成分可用于减轻氧化应激引起的心肌细胞损伤[1-2]。南瓜多糖（pumpkin polysaccharide,PP）是从南瓜中提取的有效成分，具有抗癌、抗氧化、降血糖的作用[3]。研究显示，PP与人参皂苷Rg1联合使用可降低H2O2诱导的肝细胞MDA水平，提高SOD、GSH-Px和CAT活性，减轻肝细胞氧化损伤[4]。PP对缺氧/复氧（H/R）诱导的心肌细胞的作用尚不清楚。核因子E2相关因子2(Nrf2）是氧化应激的重要调节因子，在ROS的刺激下，Nrf2进入细胞核与抗氧化反应元件（ARE）结合，进而激活下游基因，如γ-GCS表达，Nrf2/ARE信号通路在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥重要调控作用[5-6]。本研究基于Nrf2/γ-GCS信号通路，研究PP对H/R诱导的H9C2细胞损伤的影响，初步探索其作用机制。

1、材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞H9C2购自上海中科院细胞库；Nrf2抑制剂ML385购自Sigma;PP(wkq-08911,HPLC≥90%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；MDA检测试剂盒、LDH检测试剂盒、总SOD活性检测试剂盒、活性氧（ROS）检测试剂盒（DCFH-DA）、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、Nrf2抗体购自Beyotime公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、Hoechst33258购自Solbarbio公司；γ-GCS抗体购自Santa Cruz公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA试剂盒以及Alexa Fluor®488标记的IgG二抗购自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞活力检测

参考文献[7],H9C2细胞在缺氧条件下（95%N2、5%CO2）培养4 h，然后再复氧培养6 h，建立H/R细胞模型（H/R组），对照组（Control组）在正常条件下培养，使用终浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L的PP预先处理H9C2细胞8 h，再进行缺氧复氧处理，MTT试剂盒检测H9C2细胞活力。

1.2.2 细胞处理及分组

将H9C2细胞分为Con‑trol组、H/R组、南瓜多糖组（PP组）、Nrf2抑制剂组（ML385组）、PP+ML385组，Control组不做任何处理；PP组、ML385组、PP+ML385组在建立H/R模型前8 h，分别使用2.0 mg/L PP、2.0µmol/L ML385、2.0 mg/L PP+2.0µmol/L ML385预处理H9C2细胞8 h。

1.2.3细胞凋亡形态观察及凋亡率检测

各组细胞经处理后，加入Hoechst33258染色液，室温下染色5 min,PBS洗涤细胞，荧光显微镜下观察细胞形态。另取细胞使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。

1.2.4 LDH、MDA、SOD水平检测

使用试剂盒分别检测各组细胞上清液LDH水平及细胞MDA、SOD水平。

1.2.5 ROS水平检测

收集各组处理的细胞，弃去培养液，PBS洗涤细胞，加入10µmol/L的DCFH-DA荧光探针，避光孵育30 min，荧光显微镜观察并拍照，以相对荧光强度表示ROS水平。

1.2.6 炎症因子水平检测

收集各组处理后的H9C2细胞培养液，离心后收集上清，ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.2.7 Western blot检测Nrf2、γ-GCS蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，经BCA法定量分析后，电泳转膜并封闭，分别加入Nrf2(1∶1 000稀释）、γ-GCS(1∶1 000稀释）、β-actin(1∶1 000稀释）抗体，4℃孵育过夜，加入IgG二抗（1∶2 000稀释），室温孵育1 h，滴加ECL显影，以β-actin为内参，分析蛋白相对表达。

1.2.8免疫荧光检测Nrf2蛋白表达

取各组处理的细胞，4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗涤后，再使用0.5%Triton X-100室温通透20 min，封闭后加入Nrf2一抗，室温孵育1 h，加入Alexa Fluor®488标记的二抗，室温孵育1 h,DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察并拍照。

1.3 统计学分析

每组实验设置6个复孔，采用SPSS23.0软件进行统计分析，实验数据符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组H9C2细胞活力

与Control组比较，H/R组H9C2细胞活力显著降低（P<0.05）；与H/R组比较，0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L PP均可提高H9C2细胞活力，且呈浓度依赖性，给药浓度为2.0、4.0 mg/L效果较明显，但两个浓度之间差异无统计学意义，选择2.0 mg/L PP进行后续实验，见图1。2.2各组H9C2细胞形态Control组细胞形态正常，呈椭圆形，细胞核质均匀，蓝色荧光较弱；H/R组细胞的细胞核染色加深，荧光增强，表现为凋亡特征；PP组较H/R组核染色变浅，蓝色荧光减弱，ML385组较H/R组核染色加深，蓝色荧光增强；PP+ML385组较PP组核染色加深，蓝色荧光增强，见图2。

图1 PP对H/R处理的H9C2细胞活力的影响

2.3 各组H9C2细胞凋亡比较

H/R组细胞凋亡率较Control组显著升高（P<0.05）；与H/R组比较，PP组细胞凋亡率显著降低（P<0.05),ML385组H9C2细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与PP组比较，PP+ML385组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），见图3、表1。

2.4 各组H9C2细胞氧化应激指标比较

与Con‑trol组比较，H/R组LDH、MDA及ROS水平显著升高，SOD水平显著降低（P<0.05）；与H/R组比较，PP组LDH、MDA及ROS水平显著降低，SOD水平显著升高（P<0.05),ML385组LDH、MDA及ROS水平显著升高，SOD水平显著降低（P<0.05）；与PP组比较，PP+ML385组LDH、MDA及ROS水平显著升高，SOD水平显著降低（P<0.05），见图4、表2。

图2 Hoechst33258染色观察各组H9C2细胞形态（×200)

图3 各组H9C2细胞凋亡

表1 各组H9C2细胞凋亡比较

2.5 各组H9C2细胞炎症因子水平比较

与Con‑trol组比较，H/R组细胞培养液TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高（P<0.05）；与H/R组比较，PP组细胞培养液TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低（P<0.05),ML385组细胞培养液TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高（P<0.05）；与PP组比较，PP+ML385组细胞培养液TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高（P<0.05），见表3。

2.6 PP对H/R处理的H9C2细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位正常时主要显示红色荧光，下降时以绿色荧光为主，与Control组比较，H/R组细胞绿色荧光显著增强，红色荧光强度减弱；与H/R组比较，PP组绿色荧光强度减弱，红色荧光增强，ML385组细胞绿色荧光显著增强，红色荧光强度减弱；与PP组比较，H/R+ML385组细胞绿色荧光显著增强，红色荧光强度减弱，见图5。

图4 PP对H/R处理的H9C2细胞ROS的影响（DCFH-DA荧光探针法，×200)

表2 各组H9C2细胞氧化应激指标比较

表3 各组H9C2细胞炎症因子水平比较

图5 PP对H/R处理的H9C2细胞线粒体膜电位的影响（JC-1染色，×400)

图6 Western blot检测Nrf2、γ-GCS蛋白表达

2.7 PP对H/R处理的H9C2细胞Nrf2、γ-GCS蛋白表达的影响

与Control组相比，H/R组Nrf2、γ-GCS表达水平显著降低（P<0.05）；与H/R组相比，PP组Nrf2、γ-GCS表达水平显著升高（P<0.05),ML385组Nrf2、γ-GCS表达水平显著降低（P<0.05）；与PP组相比，PP+ML385组Nrf2、γ-GCS表达水平显著降低（P<0.05），见图6、表4。

表4 各组H9C2细胞Nrf2、γ-GCS蛋白表达比较

图7 免疫荧光检测Nrf2蛋白表达（×200)

免疫荧光结果显示，Control组Nrf2蛋白主要表达于细胞质，呈绿色荧光，H/R组细胞质绿色荧光减弱；与H/R组比较，PP组细胞核绿色荧光增多，表明Nrf2向核移位，ML385组细胞质绿色荧光减弱；与PP组比较，PP+ML385组细胞质与细胞核绿色荧光均减弱，见图7。

3、讨论

抑制氧化应激反应、减少心肌细胞凋亡是减轻心肌缺血再灌注损伤的重要途径，心肌细胞在缺氧复氧条件下，ROS大量聚积，促使膜脂过氧化物MDA产生，并加剧细胞损伤[8]。

ROS还可氧化线粒体膜通透性转换孔上的硫醇，导致线粒体膜电位的下降，加重损伤[9]。LDH是反映心肌损伤的标志物，其外泄水平可反映细胞膜通透性损伤的程度，SOD是抗氧化酶，可对抗脂质过氧化损伤与清除自由基[10]。研究显示，在缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤中，ROS水平及LDH漏出量增加，MDA活性增加，SOD活性降低[11]。本研究建立H/R心肌细胞损伤模型，发现PP可提高H/R处理的H9C2细胞活力，减轻细胞损伤，恢复线粒体膜电位，降低细胞凋亡，降低LDH、MDA及ROS水平，提高SOD水平。PP具有降低糖脂水平、抗肿瘤与抗氧化的作用，研究显示，PP可提高SOD活性，降低MDA和提高GSH水平，通过调节氧化应激介导的胰岛β细胞凋亡[12-13]。本研究表明PP可减轻H/R处理的H9C2细胞氧化应激损伤，减少细胞凋亡。

杨洋等[14]研究表明，叶升麻苷可通过调控Rnd3/NF-κB通路，降低HR诱导的心肌细胞LDH释放量和MDA及TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子水平，减轻心肌细胞损伤。研究显示，PP可降低大肠杆菌感染小鼠肠道中IL-6、IL-1β表达水平和提高血清过氧化氢酶活性和总抗氧化能力，通过提高抗氧化机能及抑制炎症反应减轻小鼠肠道损伤[15]。本研究结果显示，PP预处理H9C2细胞，可降低炎症因子水平，表明PP可抑制H/R处理的H9C2细胞炎症因子的释放，减轻细胞炎症损伤，但是其作用机制尚不清楚。

Nrf2与ARE结合后激活抗氧化功能，发生氧化应激时，Nrf2从胞质进入细胞核内，激活ARE,Nrf2/ARE是细胞抵御氧化应激的关键通路，激活Nrf2可减轻心肌缺血再灌注损伤[16]。Nrf2/ARE通路通过调控抑制炎症反应、氧化应激等作用对冠心病、糖尿病、心肌病等血管疾病起保护作用[17]。γ-GCS是Nrf2下游分子，依赖于转录激活子Nrf2的活性而进行表达，激活Nrf2/γ-GCS通路可减轻酒精性大鼠肝损伤，减轻肝纤维化[18]。本研究显示，PP可显著升高H/R模型细胞Nrf2、γ-GCS表达水平，并促进Nrf2蛋白从细胞质向细胞核转移，而使用Nrf2抑制剂ML385预处理细胞可显示相反的作用，表明PP可能通过上调Nrf2/γ-GCS通路，减轻H/R处理的H9C2细胞损伤。PP保护心肌损伤的作用及机制仍需结合动物模型做进一步研究。

综上所述，PP上调Nrf2/γ-GCS通路发挥抗氧化、抗炎作用，减轻H/R诱导的H9C2细胞损伤。

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