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荜茇宁对盐酸异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚的保护作用及机制

2025-08-23 48 上传者：管理员

摘要：目的研究荜茇宁对盐酸异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥厚的改善作用并初步探究其作用机制。方法通过腹腔注射ISO构建小鼠心肌肥厚模型。超声心动图评估心功能；HE染色观察心脏组织病理学改变；qRT-PCR法检测心肌肥厚标志物ANP、BNP、TGFβ1和CollⅢ的mRNA水平；Westernblot法检测心脏MAPK信号通路蛋白水平。结果与对照组相比，模型组小鼠左室射血分数(EF%)、左室缩短分数(FS%)、舒张末期左室后壁厚度(LVPWd)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWs)显著降低，左室舒张末期直径(LVIDd)、左室收缩末期直径(LVIDs)、心脏质量/体质量比值(HM/BM)显著增加；心肌肥厚标志物ANP、BNP、TGFβ1和CollⅢ的mRNA水平显著增加，MAPK的蛋白表达显著增加。荜茇宁预处理后，显著抑制了ISO诱导的上述效应。结论荜茇宁可能通过抑制MAPK信号通路改善ISO诱导的小鼠心肌肥厚，可作为干预心肌肥厚发生发展的一种潜在药物。

关键词：
MAPK
心肌肥厚
心血管疾病
盐酸异丙肾上腺素
荜茇宁
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心力衰竭是一种常见的难治性心血管疾病，病理性心肌肥厚是导致心力衰竭的主要原因[1]。病理性心肌肥厚涉及许多信号通路，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、降钙素-活化T细胞的核因子（NFAT）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路，MAPK被认为是调控心肌肥厚的重要信号通路[2-4]。

荜茇宁（piperlonguminine，GBN）是荜茇果实中发现的主要生物碱，已被证明具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗高血脂、抗肾纤维化和抗炎等特性[5-6]。多项研究发现GBN对MAPK信号通路有重要的调控作用，例如GBN能够降低p38、细胞外调节激酶（ERK1/2）和c-JunN末端激酶（JNK）的磷酸化，对抗内皮细胞蛋白C受体的脱落[7]；GBN通过促进活性氧（ROS）的生成、调节自噬、调控p38/Akt/mTOR信号通路，发挥抗肿瘤作用[8]。此外，GBN在心血管疾病的预防和治疗方面显示出良好的效果，例如GBN可能通过抑制NF-κB和MAPK信号通路，减轻血脑屏障破坏来保护大脑免受缺血性脑损伤[9]；能够激活醛脱氢酶降低脂醛浓度保护心脏，从而改善心脏缺血/再灌注事件中产生的细胞损伤[10]。然而，GBN对心肌肥厚的作用及心肌MAPK信号通路的影响目前尚不明确。基于此，本研究旨在探索GBN能否改善异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导的心肌肥厚并探讨其对心肌MAPK信号通路的影响，为临床开发治疗心肌肥厚的中草药提供理论依据。

1、材料

1.1　实验动物　　

40只8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重23～26g[北京华阜康生物科技公司，生产许可证号：SCXK（京）2019-0008]。饲养在清洁级动物房中，适应性喂养一周后再进行实验。动物实验伦理许可证号为No.[2021]伦理第[112-1]号。

1.2　试药　　

ISO（Sigma公司）；GBN（有效成分含量98%，成都普思生物科技股份有限公司，批号：5950-12-9）；PrimeScriptRT试剂盒（Takara）；p38抗体、p-p38抗体、ERK抗体、p-ERK抗体、JNK抗体、p-JNK抗体、GAPDH抗体（Abcam公司）。

1.3　仪器　　

Vevo2100型小动物超声仪（加拿大VisualSonics公司）；ND-2000分光光度计（ThermoFisher）；RocheLightCycler96实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（Hoffmann-LaRocheLtd）；Bio-RadChemiDocTouch化学发光凝胶成像系统（Biorad）。

2、方法

2.1　实验分组与处理　　

40只C57BL/6小鼠随机分为4组，每组10只。GBN溶解在1mL的二甲基亚砜（DMSO）中，配成工作液。将ISO和GBN工作液分别溶于无菌生理盐水中。实验设置：①对照组（Control组），每日腹腔注射等量无菌生理盐水；②GBN组，每日腹腔注射GBN10mg/（kg·d）[11]；③ISO组，每日腹腔注射ISO15mg/（kg·d）；④ISO＋GBN组，腹腔注射GBN10mg/（kg·d）、ISO15mg/（kg·d）。各组小鼠均连续给药14d。

2.2　超声心动图测量和评估左心室功能　　

给药14d后进行超声心动图检查，测量并计算左室射血分数（EF%）、左室缩短分数（FS%）、左室舒张末期直径（LVIDd）、左室收缩末期直径（LVIDs）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）。在完成心脏功能检测后，小鼠称重后麻醉固定，迅速取出心脏称重，计算心脏质量/体质量比值（HM/BM）。

2.3　心肌组织HE染色　　

从小鼠体内分离心脏，甲醛固定过夜，将组织包埋在石蜡块中，制备组织切片进行常规的HE染色并在光学显微镜下评估心脏组织学变化。

2.4qRT-PCR测定心肌肥厚标志物的表达　　

使用TRIzol试剂提取心脏组织总RNA。使用PrimeScriptRT试剂盒进行逆转录反应。实时qRTPCR在ABIPrism7900系统上进行。将靶基因ANP、BNP、TGFβ1、CollⅢ的mRNA表达标准化为GAPDH的内源表达，并表示为相对于对照的倍数变化。使用2－ΔΔCT方法进行分析。本研究用于扩增的引物序列见表1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1qRT-PCR检测小鼠心肌肥厚标志物基因的引物序列

2.5Westernblot测定各组心脏组织的p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白表达水平

通过Westernblot分析测量小鼠心脏组织的磷酸化蛋白和总蛋白含量。等量的蛋白质（20μg）经10%～15%梯度的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上。膜用含有Tween-20和5%牛血清白蛋白的Tris缓冲盐水在室温下封闭2h，加入稀释度的一抗（1∶1000）在4℃下孵育过夜，然后与二抗（1∶5000）孵育，检测目标蛋白，利用超敏ECL化学发光试剂盒和化学发光凝胶成像系统将免疫印记可视化，利用ImageJ软件对免疫印记进行灰度分析。

2.6　统计学方法　　

数据采用平均值±标准误差（x±SE）表示。使用GraphPadPrism6.0软件进行统计分析。使用单因素方差分析确定统计显著性。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1GBN对ISO所致的心肌肥厚小鼠的心功能的影响　　

如图1和图2所示，与Control组相比，ISO组小鼠的EF%和FS%显著降低，但ISO＋GBN组改善了这种降低。此外，与Control组相比，ISO组小鼠的LVIDd（mm）和LVIDs（mm）显著增加，而GBN在一定程度上减轻了ISO诱导的心肌肥厚小鼠LVIDd和LVIDs的增加；与Control组相比，ISO组小鼠的LVPWd（mm）和LVPWs（mm）显著降低，而GBN在一定程度上减轻了ISO诱导的心肌肥厚小鼠LVPWd和LVPWs的降低。此外，与Control组相比，ISO组小鼠的HM/BM显著升高，ISO＋GBN组显著改善了这种升高。

图1　各组小鼠心脏超声模式图

图2　荜茇宁对ISO诱导的心肌肥厚小鼠心功能的影响

3.2GBN对ISO所致的心肌组织病理学变化的影响　　

如图3A所示，Control组小鼠心脏大小正常，ISO组小鼠心脏肥大，ISO＋GBN组小鼠心脏大小与对照组接近。如图3B所示，在×200显微镜下观察HE组织病理学改变，结果显示，Control组的心脏组织表现出正常的组织学结构，心肌细胞排列整齐，形态规则，大小均一，周围无炎症细胞浸润，组织中没有观察到病理改变。相比之下，ISO组细胞发生了明显的形态变化，左室心肌细胞出现肥大，细胞形态不规则，排列紊乱，细胞核有明显皱缩现象，周围有炎症细胞浸润。在GBN的干预下，模型组的病理学变化得到了改善，细胞排列较整齐，形态较规则，肥大细胞减少，仅有少数炎症细胞浸润。

3.3GBN对ANP、BNP、TGFβ1和CollⅢ的mRNA表达水平的影响

利用qRT-PCR法检测心肌肥厚标志物心房钠尿肽（ANP）和脑钠尿肽（BNP）的mRNA表达水平。与Control组相比，ISO组表达水平显著升高，而在GBN的预处理下，ANP和BNP的mRNA表达水平显著下调。除了心肌细胞肥大，心肌肥厚的另一个重要病理表现是心肌间质纤维化增加，因此，本研究检测了心肌纤维化相关标志物转化生长因子-β1（TGFβ1）和Ⅲ型溶胶原（CollⅢ）的mRNA表达水平，与Control组相比，ISO组表达水平显著升高，而在GBN的预处理下，TGFβ1和CollⅢ的表达水平显著下调。结果如图4所示。

图3　荜茇宁对ISO诱导的心肌肥厚小鼠心脏组织病理学变化的影响

图4　荜茇宁对ISO诱导的心肌肥厚小鼠心肌肥厚标志物mRNA表达的影响

3.4GBN对ISO诱导的心肌肥厚小鼠心脏MAPK信号通路的影响　　

为了研究GBN的抗心肌肥厚机制，本研究检测了MAPK主要亚家族p38、细胞外信号调节激酶（ERK）和c-JunN-末端激酶/应激活化蛋白激酶（JNK）及其磷酸化p-p38、p-ERK、p-JNK的蛋白表达水平。结果显示ISO组p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达水平较Control组显著升高。而GBN的干预显著降低了p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK的蛋白表达水平。表明GBN能显著降低ISO诱导的MAPK亚家族蛋白磷酸化。结果如图5所示。

图5　荜茇宁对ISO诱导的心肌肥厚小鼠心肌组织p38、ERK、JNK蛋白磷酸化水平的影响

4、讨论与结论　　

心肌肥厚是心血管疾病发生发展的独立危险因素[12]。临床研究表明，少数药物如钙通道阻滞剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂等在预防和改善心肌肥厚方面可能有有益作用[13]。但这些药物均为降压药，不适用于基线血压较低的患者。因此，需要进一步开发出能够有效治疗心肌肥厚的药物来更好地控制临床心肌肥厚的发展。

本研究发现GBN能抑制ISO引起的心肌肥厚。通过检测小鼠的心功能、心脏组织病理学、心肌肥厚相关标志物以及心肌纤维化相关标志物的mRNA表达，显示GBN改善了ISO所致的小鼠心肌肥厚病理变化。

MAPK信号通路在心肌肥厚的发生和进展中发挥着至关重要的作用。MAPK亚家族主要包括p38、JNK、ERK，其能够被各种细胞外和细胞内信号激活，调节多种细胞过程，如增殖、分化、细胞存活和凋亡[14-15]。MAPK信号通路的激活是细胞内磷酸化级联反应的最终步骤[16]。MAPK亚家族中的每一种磷酸化，在心脏肥厚中具有重要的作用。例如ERK1/2磷酸化通常与促进肥大生长相关，而p38和JNK磷酸化通常与应激反应和细胞凋亡相关[17]。此外，MAPK信号传导的长期激活会导致不良重塑、纤维化，并最终导致心力衰竭。例如，研究表明p38的持续激活与心脏细胞凋亡和纤维化增加有关，从而导致代偿性肥大向心力衰竭的转变[17]。总之，MAPK信号通路是心肌肥厚的核心信号通路，它的激活能导致肥大基因的表达并导致心脏组织的重塑。因此挖掘影响MAPK信号通路的抗心肌肥厚药物，可能为临床开发预防或逆转病理性心肌肥厚的药物提供有价值的参考。

既往研究表明，GBN可以通过抑制MAPK发挥抗炎、抗肿瘤等作用[7，9]。本研究首次发现GBN抑制了心肌肥厚小鼠心肌MAPK家族p38、ERK、JNK蛋白的磷酸化，提示其可能通过抑制MAPK信号通路改善ISO所致小鼠心肌肥厚。本研究结果表明，GBN可作为一种治疗心肌肥厚的潜在药物。

参考文献:

[16]余元勋,鲍远程.中国疾病信号通路与靶向治疗学[M].合肥:安徽科学技术出版社,2013.

基金资助:内蒙古自治区卫生健康委员会基金(No.202201147);

文章来源:王志华,初雨萌,张嫒,等.荜茇宁对盐酸异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚的保护作用及机制[J].中南药学,2025,23(08):2272-2276.