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三七皂苷R2对棕榈酸诱导H9c2心肌细胞脂毒性的影响

2024-11-26 87 上传者：管理员

摘要：目的研究三七皂苷R2（NGR2）对棕榈酸（PA）诱导H9c2心肌细胞脂毒性的影响。方法将H9c2心肌细胞分为对照组、模型组和低、高剂量实验组。对照组给予10%牛血清白蛋白（BSA）处理；模型组给予250μmol•L-1 PA以建立脂毒性模型；低、高剂量实验组分别给予50、100μmol•L-1 NGR2和250μmol•L-1 PA处理。用油红O和Bodipy染色法观察细胞脂滴积累情况，用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法检测脂质代谢相关的脂肪酸合成酶（FASN）、硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1） mRNA相对表达水平，用蛋白质印迹法检测FASN、SCD1蛋白的相对表达水平。结果对照组、模型组和低、高剂量实验组的油红O染色后脂滴定量光密度值分别为0.12±0.03、0.19±0.02、0.14±0.05和0.11±0.03,Bodipy染色定量相对荧光强度分别为（100.00±15.83）%、（249.65±6.44）%、（160.88±17.34）%和（136.84±4.83）%,FASN mRNA相对表达水平分别为1.00±0.07、1.33±0.13、1.21±0.16和1.05±0.09,SCD1 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.04、1.26±0.07、1.24±0.15和1.02±0.09,FASN蛋白相对表达水平分别为1.00±0.00、1.03±0.02、1.01±0.06和0.92±0.08,SCD1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.00、1.08±0.08、0.98±0.15和0.87±0.18。模型组的上述指标与对照组比较，高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）;低剂量实验组的油红O和Bodipy染色定量与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论 NGR2可能通过降低FASN、SCD1 mRNA和蛋白表达，减少脂质积累，减轻PA诱导H9c2心肌细胞的脂毒性。

关键词：
H9c2心肌细胞
三七皂苷R2
棕榈酸
脂毒性
脂质代谢;
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糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是由于心肌内脂质蓄积、心脏结构和功能改变引发的糖尿病并发症，其主要表现为心肌纤维化、左心室肥大，最终导致心功能障碍和心力衰竭[1]。DCM发病机制复杂，涉及脂毒性、线粒体功能障碍、氧化应激等多种因素[2]。三七皂苷R2(notoginsenoside R2,NGR2)是三七中的一种活性成分。研究表明，三七皂苷类成分对DCM具有良好的保护作用，且NGR2对脂肪组织、肝具有良好的降脂活性[3-5]。本研究通过建立棕榈酸(palmitic acid, PA)诱导H9c2心肌细胞的脂毒性模型，探讨NGR2对心肌细胞脂毒性的保护作用及其作用机制。

1、材料与方法

1材料

细胞大鼠H9c2心肌细胞，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

药品与试剂NGR2(S型),规格：每管10 mg,含量：>98%,批号：J0603BS,大连Meilunbio公司生产；PA,规格：每管20 mg,批号：519B024,北京Solarbio公司生产。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),德国PAN SERATECH公司生产；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8),上海Beyotime公司生产；牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(不含脂肪酸)、0.25%胰蛋白酶、双抗、油红O染色液、Hoechst 33342染色液，均由北京Solarbio公司生产；Bodipy 493/503中性脂滴荧光探针试剂，广州沛瑜生物技术有限公司生产；脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)抗兔多克隆抗体、乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-coenzyme A carboxylase 1,ACC1)抗兔多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗兔单克隆抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)二抗，均由Proteintech(中国)公司生产；硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-coenzyme A desaturase 1,SCD1)抗兔单克隆抗体，由美国Cell Signaling公司生产；高糖Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM)、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer solution, PBS)、Hifair®Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)反转录试剂盒和Hieff UNICON®qPCR预混液(抗体法/No Rox)试剂盒，均由上海Yeasen公司生产。引物，均由上海生工生物工程有限公司设计与合成。

仪器Synergy H1全功能酶标仪，美国BioTek公司产品；C1000 Touch实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)仪、Mini-PROTEAN®Tetra电泳槽，均为美国BIO-RAD公司产品；e-BLOT接触式化学发光成像系统，上海易孛特公司产品。

实验方法

2.1细胞培养

H9c2心肌细胞培养于高糖DMEM完全培养基中(含10% FBS,100 U·mL-1青霉素和100μg·mL-1链霉素),置于37℃、5% CO2培养箱中。稳定传代后，取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2溶液配制

NGR2溶液配制称量NGR2 10 mg,溶解于二甲基亚砜260μL中，制备成50 mmol·L-1NGR2储存溶液。

PA溶液配制[6]将PA溶解在0.1 mol·L-1NaOH溶液中，并于70℃水浴加热2 min,然后迅速加入10% BSA中(PA∶BSA=1∶9),37℃孵育1 h得到终浓度为10 mmol·L-1PA溶液。于超净台上，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，置于-20℃储存，备用。使用前用37℃水浴15 min。

2.3 CCK-8法检测细胞活力[7]

取对数生长期的细胞进行实验，细胞以1×105cell·mL-1的密度接种于96孔板中，每孔100μL。24 h后，进行浓度依赖性实验：加入不同浓度的PA(0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00μmol·L-1)处理48 h,正常对照组为不含PA,含10% BSA的完全培养基处理48 h;加入相同造模浓度的PA,同时加入不同浓度的NGR2(0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol·L-1)处理48 h。弃掉原有的培养基，每孔加入不含血清的培养基100μL,再加入CCK-8试剂10μL,轻微振荡后37℃孵育2 h,于450 nm波长下检测光密度值(optical density, OD)。按照公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=OD实验组/OD对照组×100%。

2.4细胞分组与给药方法

用250μmol·L-1PA诱导H9c2细胞建立脂毒性模型[6]。取对数生长期的H9c2心肌细胞，随机分为对照组(含10% BSA的DMEM培养基)、模型组(含250μmol·L-1PA的DMEM高糖培养基)和低、高剂量实验组(含250μmol·L-1PA,且分别含50、100μmol·L-1NGR2的DMEM高糖培养基)。4组细胞均培养48 h。

2.5油红O染色观察细胞脂滴积累[8]

按照“2.4”进行分组和处理。4%多聚甲醛固定30 min, PBS清洗3次后，加入油红O染色液避光染色30 min。回收多余染色液，PBS清洗3次，于光学显微镜下观察油滴并拍照。拍照结束后，每孔加入异丙醇溶解油红O,然后加入96孔板中，用酶标仪测量358 nm处的OD值，以量化脂滴积累。

2.6 Bodipy染色观察细胞脂滴累积[9]

按照“2.4”进行分组和处理。4%多聚甲醛固定30 min, PBS清洗3次后，加入Bodipy染色液37℃避光染色30 min。加入Hoechst染色液室温染核10 min, PBS清洗3次后，在荧光倒置显微镜下拍照。用Image J软件分析细胞相对荧光强度。

2.7 RT-qPCR法检测心肌细胞脂质代谢相关基因转录水平[10]

按照“2.4”进行分组和处理。用Trizol法提取总RNA,Nanodrop测定RNA浓度和纯度。取总RNA 1μg,用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA,暂存于-20℃待用。按照Hieff UNICON®qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒进行RT-qPCR反应。以2-ΔΔCT法分别计算待测基因mRNA相对转录水平。

2.8蛋白质印迹法检测相关蛋白的表达水平[11]

按照“2.4”进行分组和处理。细胞刮板刮下孔板内细胞，常规提取细胞总蛋白，用BCA法定量测定蛋白浓度。取蛋白40μg进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h,分别加入兔抗鼠FASN、ACC1、SCD1一抗(1∶1 000),4℃孵育过夜。次日加入二抗(1∶5 000),室温孵育2 h, ECL发光液进行化学发光，显影后用e-BLOT进行扫描分析。用Image J软件分析蛋白条带，以灰度值表示。

3统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。计数资料以百分率(%)表示，用χ2检验。

2、结果

1 PA和NGR2对H9c2心肌细胞存活率的影响

用0、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1 000.00μmol·L-1PA干预48 h后，H9c2心肌细胞的存活率分别为(100.00±2.30)%、(98.07±2.42)%、(100.23±2.33)%、(103.49±2.28)%、(49.43±5.43)%、(5.94±0.95)%和(4.34±1.21)%。当PA浓度为250.00μmol·L-1时，心肌细胞的存活率达半数抑制。在250.00μmol·L-1PA条件下，同时加入0、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μmol·L-1NGR2,H9c2心肌细胞的存活率分别为(100.00±1.95)%、(99.20±1.69)%、(98.22±2.51)%、(97.95±3.98)%、(97.83±3.09)%和(97.28±4.34)%。0、6.25、12.25、25.00、50.00、100.00μmol·L-1NGR2对H9c2心肌细胞的存活率无显著影响。故选择250μmol·L-1PA进行造模，选择50、100μmol·L-1NGR2进行后续实验。

2油红O染色观察NGR2对PA诱导H9c2心肌细胞脂滴积累的影响

对照组给予含10% BSA的DMEM培养基；模型组给予含250μmol·L-1PA的DMEM高糖培养基；低、高剂量实验组分别给予含250μmol·L-1PA+50、100μmol·L-1NGR2的DMEM高糖培养基。

对照组细胞密集分布，呈梭形，细胞内存在少量脂滴，呈橘红色；模型组细胞内大量脂滴形成，呈深红色；低、高剂量实验组大部分细胞仍可见少量脂滴，但相较于模型组，细胞脂滴较少，着色浅，见图1。

对照组、模型组和低、高剂量实验组脂滴的OD值分别为0.12±0.03、0.19±0.02、0.14±0.05和0.11±0.03。模型组与对照组比较，低、高剂量实验组与模型组比较，脂滴的OD值在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3 Bodipy染色观察NGR2对PA诱导H9c2心肌细胞脂滴积累的影响

对照组细胞内脂滴呈现绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光；模型组与正常对照组比较，细胞绿色荧光强度增加，表明PA干预后细胞内脂滴增加；低、高剂量实验组与模型组比较，绿色荧光强度均降低，表明NGR2可降低细胞脂滴的积累，见图2。

图1用油红O染色观察H9c2心肌细胞脂滴积累(×200)

对照组、模型组和低、高剂量实验组脂滴的相对荧光强度分别为(100.00±15.83)%、(249.65±6.44)%、(160.88±17.34)%和(136.84±4.83)%。模型组与对照组比较，低、高剂量实验组与模型组比较，Bodipy染色脂滴的相对荧光强度在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。

4 NGR2对PA诱导H9c2心肌细胞脂质代谢基因mRNA表达水平的影响

如表1所示，模型组与对照组比较，FASN、ACC1、SCD1 mRNA相对表达水平均显著增加，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01);高剂量实验组与模型组比较，FASN、SCD1 mRNA相对表达水平均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.01)。

5 NGR2对PA诱导H9c2心肌细胞脂质合成蛋白表达水平的影响

模型组与对照组比较，FASN、SCD1蛋白相对表达水平均显著增加，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);高剂量实验组与模型组比较，FASN、SCD1蛋白相对表达水平均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。

图2用Bodipy染色观察H9c2心肌细胞脂滴积累(×200)

表1三七皂苷R2(NGR2)对PA诱导H9c2心肌细胞脂质代谢基因mRNA表达水平的影响

表2NGR2对PA诱导H9c2心肌细胞脂质合成蛋白表达水平的影响

3、讨论

在DCM发生的早期阶段，由于心肌细胞对脂肪酸的摄取和利用失衡，脂质大量沉积，心脏负荷加重引起心脏结构和功能改变，诱发脂毒性。脂毒性诱发心肌炎症、氧化应激和胰岛素抵抗，导致心肌纤维化和心功能障碍，最终进展为心力衰竭[12]。因此，通过调节心肌脂肪酸代谢平衡，是减轻脂毒性和预防DCM的有效治疗手段。FASN和ACC1是参与脂肪酸从头合成的限速酶，SCD1是将饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的限速酶，研究显示SCD1下调有助于减轻脂毒性和改善心功能[13]。过氧化物酶体增殖激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPARα)、肉碱棕榈酰转酯酶-1(carnitine palmitoyl transterase-1,CPT1)参与调控线粒体的β氧化，在DCM中显著上调[14]。本研究PA诱导H9c2心肌细胞后，FASN、SCD1表达水平均显著升高，NGR2干预后，高剂量的实验组FASN、SCD1蛋白和mRNA相对表达水平均显著下调，表明心肌细胞内脂质代谢明显改善；结果显示，NGR2对PPARα、CPT1 mRNA表达均无显著影响，表明NGR2对线粒体β氧化作用不明显。本研究通过油红O染色和Bodipy染色结果表明，NGR2能够降低PA诱导心肌细胞脂毒性模型的脂滴积累，mRNA和蛋白结果进一步表明NGR2可能通过降低FASN和SCD1的表达，抑制心肌细胞内脂质合成，改善心肌细胞脂毒性。

参考文献:

[7]杨茹,覃金红,刘丹霞,等.小檗碱对棕榈酸诱导大鼠心肌细胞H9c2脂毒性损伤的影响[J].中国药师,2022,25(10):1703—1707.

基金资助:中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金资助项目(2022-I2M-1-018);

文章来源:王圣晨,李晓亚,毛小爽,等.三七皂苷R2对棕榈酸诱导H9c2心肌细胞脂毒性的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(22):3254-3258..