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肺动脉高压中NF-κB对IL-6表达的调控作用研究

2021-07-29 301 上传者：管理员

摘要：目的研究肺动脉高压中巨噬细胞内核因子κB(NF-κB)对白细胞介素-6(IL-6)表达的调控作用。方法选取健康雄性Sprague-Dawley大鼠24只,随机分3组,每组各8只。对照组颈背部皮下注射生理盐水1次,饲养4周;4周组、6周组颈背部皮下注射野百合碱(60mg/kg)1次,分别饲养4周、6周。测量右心室平均压及收缩压,处死后分别称量右心室和左心室+室间隔,计算右心肥厚指数。左肺组织行苏木精-伊红染色(HE染色)及免疫组织化学染色。取大鼠右肺组织,进行实时聚合酶链式反应(RT-PCR),测定肺组织中IL-6和NF-κB的相对水平。取健康小鼠巨噬细胞培养,给予低氧刺激,测定低氧刺激条件下各时间点(2、6、12、24、48h)IL-6和NF-κB的表达。结果对照组、4周组、6周组大鼠右心室收缩压、平均压及右心肥厚指数均逐渐升高。4周组、6周组的右心室收缩压及平均压、右心肥厚指数均较对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05),4周组与6周组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。左肺组织HE染色,4周组、6周组肺血管周围淋巴细胞浸润明显;行免疫组织化学染色,4周组、6周组巨噬细胞浸润明显,IL-6及NF-κB表达增加。4周组、6周组大鼠右肺组织NF-κB、IL-6的mRNA表达均较对照组增高,差异均有统计学意义(P<0.05),6周组大鼠右肺组织NF-κB、IL-6的mRNA表达较4周组增加,但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠右肺组织中IL-6和NF-κB的mRNA表达趋势相同。2、6、12、24、48h巨噬细胞IL-6和NF-κB的mRNA表达均较对照组增加,且两者在各时间段内的表达趋势相同。结论肺动脉高压中IL-6的表达途径可以通过NF-κB调控完成。

关键词：
巨噬细胞
核因子κB
白细胞介素-6
肺动脉高压
野百合碱
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肺动脉高压是一个复杂、多因素影响的疾病，其特征是肺动脉重构、肺血管阻力升高和右室肥厚[1,2]，但其机制尚不十分清楚。目前认为，免疫和炎症在肺动脉高压中起重要作用[3,4]，其中以巨噬细胞、白细胞介素-6(IL-6）及核因子κB(NF-κB）最为突出[5,6,7]。本研究旨在通过测定肺动脉高压大鼠肺组织IL-6及NF-κB水平，以及低氧刺激下不同时间段小鼠巨噬细胞IL-6和NF-κB的表达，探讨肺动脉高压中巨噬细胞内NF-κB对IL-6表达的调控作用。现报道如下。

1、材料与方法

1.1一般材料

本实验采用健康雄性Sprague-Dawley大鼠（无特定病原体），鼠龄6周，体重200～240g，购于中国军事医学科学院[许可证号：SCXK-（军）2007-004]。在首都医科大学附属北京安贞医院实验动物中心寄养，自由进食饮水，适应性饲养3～4d后进行实验。实验人员已获得《北京市实验动物从业人员岗位证书》，动物饲养符合“北京市实验动物管理条例”和“实验动物福利伦理审查指南”。

1.2方法

1.2.1肺动脉高压模型建立与分组

选取体重200～240g的健康雄性SD大鼠24只，随机分为对照组、4周组、6周组，每组各8只。对照组颈背部一次性皮下注射0.9%氯化钠溶液1mL，饲养4周。配制野百合碱，首先溶于适量1mol/L盐酸中，然后以0.1mol/L氢氧化钠调节pH至7.4，最后用0.9%氯化钠液配置成终浓度为20g/L的溶液。4周组、6周组给予颈背部皮下注射野百合碱（60mg/kg)1次（注射液体量约为1mL），分别饲养4周、6周。实验动物均给予普通饮食，自由饮水。

1.2.2右心室测压

对照组、4周组、6周组大鼠均在注射生理盐水（或野百合碱）后28、42d称重，应用戊巴比妥30mg/kg麻醉后，由剑突下行腹部切口，将头皮针由腹腔经横膈膜插入右心室，用BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司），测定右心室收缩压及平均压。

1.2.3计算右心肥厚指数

测压完成后经心尖取血，开胸取出心肺。分离心脏，剪去心房及大血管根部，参考JULIAN等[8]和MONGE等[9]介绍的方法，分离右心室和左心室加室间隔：沿房室沟剪去心房及大血管根部，沿室间隔分离右心室、左心室加室间隔，滤纸吸干水分后分别称重，计算右心室肥厚指数，判断右心室肥厚程度。

1.2.4组织标本的制备及指标的观察

肺组织切片后用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，制作切片，行苏木精-伊红染色（HE染色），光镜观察炎症细胞浸润，观察肺血管周围淋巴细胞浸润情况。行肺组织免疫组织化学染色，免疫组织化学过程分别选巨噬细胞CD68、IL-6及NF-κB一抗和相应的二抗做肺组织染色。观察染色情况。

1.2.5大鼠右肺组织IL-6和NF-κB的mRNA表达检测

将右肺组织从液氮中取出，应用Trizol液，按流程给予提取、分离、沉淀、洗涤、溶解RNA，测定RNA纯度良好，保存RNA。应用Promega-RNA逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA模板链。采用Primer3.0设计实时聚合酶链式反应（RT-PCR）所用cDNA引物：NF-κB（大鼠）上游CACCAAAGAC-CCACCTCACC，下游CCGCATTCAAGTATAGTC-CC;IL-6（大鼠）上游CCCACCAGGAACGAAAGT-CA，下游GCGGAGAGAAACTTCATAGCTGTT。由生物公司（北京三博远志生物技术有限公司）进行引物合成。配置PCR反应液，进而给予两步法PCR扩增程序。目前基因表达采用比较CT值法。

1.2.6低氧诱导小鼠巨噬细胞中IL-6和NF-κB的mRNA表达检测

采用8周龄健康雄性C57BL/6小鼠胫骨股骨和髂骨分离巨噬细胞，培养5d后种于6孔板中，缺氧时间分别为0、2、6、12、24、48h。利用乏氧培养箱（37℃恒温箱内，持续通入94%N2、5%CO2、1%O2的混合气体）制造细胞缺氧环境，诱导巨噬细胞发生极化。收取上述诱导模型的细胞，应用同上RT-PCR方法测定IL-6及NF-κB的表达。其中，RT-PCR所用cDNA引物为：NF-κB（小鼠）上游CAA-CACTGCCGAGCTCAAGA，下游CGAGGCAGCTCCCAGAGTT;IL-6（小鼠）上游CTTCCATCCAGT-TGCCTTCTTG，下游AATTAAGCCTCCGACTT-GTGAAG。

1.3统计学处理

采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学处理。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，数据符合正态分布及方差齐性时，两两组间比较采用LSD法检验；数据正态分布但方差不齐时，两两组间比较采用Games-Howell法检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1肺动脉高压模型建立

大鼠在注射野百合碱后第3周出现体毛暗淡无泽、反应迟钝、活动度下降，并且大鼠体重较此前下降，4周组大鼠在第25天死亡1只。第6周时部分大鼠出现呼吸急促，呼吸困难，喜站立，在第39、第41天共有2只大鼠死亡。死亡大鼠解剖后可见胸腔、腹腔积液。对照组、4周组、6周组的右心室收缩压及平均压逐渐升高，见表1。对照组、4周组、6周组大鼠右心肥厚指数逐渐升高，见表2。对照组、4周组、6周组大鼠右心室收缩压、平均压及右心肥厚指数均逐渐升高。4周组、6周组的右心室收缩压及平均压、右心肥厚指数均较对照组升高，差异均有统计学意义（P<0.05);4周组与6周组上述数据比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.2大鼠肺组织中炎症细胞及炎症细胞因子

显微镜下，野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺组织HE染色后，可见大量淋巴细胞浸润，特别在血管周围，尤其是外径大小相近的血管；4周组与6周组大鼠血管壁明显增厚（图1）。肺组织免疫组织化学染色后，可见巨噬细胞浸润增加（图2),IL-6和NF-κB高表达，见图3～4。

表13组大鼠收缩压与平均压比较（±s)

注：1mmHg=0.133kPa。

表23组大鼠右心肥厚指数比较（±s)

图13组大鼠肺组织HE染色图

A为对照组大鼠肺组织HE染色（400×）；B为4周组大鼠肺组织HE染色（400×）；C为6周组大鼠肺组织HE染色（400×）。

图23组巨噬细胞免疫组织化学染色图

A为对照组巨噬细胞免疫组织化学染色（400×）；B为4周组巨噬细胞免疫组织化学染色（400×）；C为6周组巨噬细胞免疫组织化学染色（400×）。

图33组NF-κB免疫组织化学组化染色图

A为对照组NF-κB免疫组织化学组化染色（400×）；B为4周组NF-κB免疫组织化学组化染色（400×）；C为6周组NF-κB免疫组织化学组化染色（400×）。

图43组IL-6免疫组织化学染色图

A为对照组IL-6免疫组织化学染色（400×）；B为4周组IL-6免疫组织化学染色（400×）；C为6周组IL-6免疫组织化学染色（400×）。

2.3肺组织RT-PCR检测IL-6和NF-κB表达水平情况

各组大鼠肺组织的RT-PCR结果提示：4周组、6周组肺组织NF-κB的mRNA表达均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；虽然6周组NF-κB的mRNA表达高于4周组，但2组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。4周组、6周组肺组织IL-6的mRNA表达均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05），但4周组、6周组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。IL-6和NF-κB的mRNA表达在各组大鼠中趋势相同。见图5～6。

图5肺组织IL-6的mRNA表达图

图6肺组织NF-κB的mRNA表达图

2.4低氧诱导小鼠巨噬细胞中IL-6和NF-κB的mRNA表达情况

采用相对定量RT-PCR对低氧条件下巨噬细胞IL-6和NF-κB的mRNA表达情况进行分析，结果表明，低氧时间分别为2、6、12、24、48h的巨噬细胞其IL-6和NF-κB的mRNA表达均高于0h，且其在各时间段内的表达趋势相同。见图7～8。

图7低氧条件下不同时间点小鼠巨噬细胞的NF-κB的mRNA表达

图8低氧条件下不同时间点小鼠巨噬细胞的IL-6的mRNA表达

3、讨论

野百合碱是常用的肺动脉高压造模方法。目前研究认为大鼠一次性注射野百合碱2～3周后肺动脉血管就会发生纤维化、硬化，导致肺动脉血管管腔狭窄，血栓形成、阻塞等。第4周时即可出现肺动脉压力明显升高，右心室肥厚，同时出现肺动脉中膜增厚、肌化程度增加及内膜增生[10]。本研究中，注射野百合碱的4周组、6周组大鼠3周开始一般情况变差，4周后测右心室压力及右心肥厚指数均高于对照组，肺组织HE染色后可见4周组、6周组大鼠血管壁明显增厚，说明造模成功。

目前认为，炎性反应、基因突变、环境及代谢功能改变等均可能参与肺动脉高压的形成机制[11]。在肺动脉高压模型中，肺血管周围可见大量巨噬细胞浸润[12]。有研究发现，巨噬细胞在肺血管重建的起始和维持中起重要作用[13]。IL-6可由巨噬细胞分泌产生，而IL-6在肺动脉高压中明显高表达，并且可能与其预后相关[14]。NF-κB参与许多细胞因子及炎症细胞因子基因表达的转录调控，在炎性反应的细胞因子网络调节中起关键作用。NF-κB激活后，可启动和调控一系列参与炎性反应的炎症细胞因子的表达[15]。低氧性肺动脉高压大鼠实验中发现，肺组织的NF-κB表达增加[16]。在本研究中，野百合碱诱导肺动脉高压模型中可见巨噬细胞、NF-κB、IL-6表达增加，在该实验中NF-κB与IL-6的表达随大鼠肺高压的严重程度增加而增加，进一步说明两者在肺动脉高压中有重要作用。

NF-κB与IL-6之间存在密切关系，低氧增加IL-6的mRNA水平，其可能通过NF-κB/IL-6[17]通路发生。既往研究表明，C反应蛋白（CRP）的致动脉粥样硬化作用是通过激活NF-κB而介导的[18]。有研究完成了KF-κB途径介导CRP对肺动脉平滑肌细胞的促炎作用，证明CRP可能是激活人肺血管平滑肌细胞中NF-κB信号，介导IL-6表达，提示肺动脉高压过程中两者之间存在关系[19]。本实验中，肺动脉高压大鼠IL-6和NF-κB的表达趋势一致，也提示在肺动脉高压中NF-κB可能调控IL-6的表达。低氧条件下小鼠巨噬细胞内NF-κB与IL-6的mRNA表达一致，进一步提示NF-κB可能参与肺高压中巨噬细胞IL-6的表达调控。

参考文献:

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文章来源：侯微微,张少辉,刘双.肺动脉高压中NF-κB对IL-6表达的调控作用研究[J].现代医药卫生,2021(14):2389-2393.