三分之二的糖尿病相关死亡是由动脉粥样硬化性心血管疾病引起的[1],其危害十分严重。利拉鲁肽(liraglutide, Lir)是胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)的类似物，可通过下调主动脉晚期糖基化终末产物受体(the receptor of advanced glycation endproducts, RAGE)的表达降低动脉粥样硬化病变程度[2],目前被广泛用于糖尿病合并心血管疾病患者的治疗。但其临床应用局限为需要频繁的肠胃外注射。为此，既往研究者合成了一种具有缓释特性的利拉鲁肽抗脂肪口服纳米制剂[3]。

细胞膜包被的纳米颗粒[cell membrane-coated nanoparticles(NPs),CNPs]被开发为仿生纳米药物递送系统，可解决合成纳米载体的过早清除、毒性和免疫原性问题[4]。有研究表明，血小板与斑块有较强的亲和性，可以靶向动脉粥样硬化病变部位[5,6]。基于以上发现，本研究制备了一种具有靶向和缓释双功能的新型载药血小板膜仿生纳米载体，该材料结构稳定，细胞功能良好。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血小板来源：

采集新鲜小鼠全血浓缩血小板，-80 ℃保存。

1.1.2 主要试剂：

人胚胎肾细胞系(human embryonic kidney 293T,HEK293T)、牛血清白蛋白(bovine-serum albumin, BSA)、2-吗啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulphonic acid, MES)溶液(Sigma-Aldrich公司);氢氧化钠、盐酸、十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS)和二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)(阿拉丁公司);利拉鲁肽(MCE公司);利拉鲁肽检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)(武汉云克隆科技股份有限公司);细胞和组织裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血小板膜碎片(platelet membrane fragments, PMF)的制备：

按照文献[7]中的方法制备血小板膜碎片。

1.2.2 BSA纳米颗粒的制备：

1)BSA活化：称取120 mg BSA,60 mg SDS和4.4 mg DTT,置于5 mL样品瓶中，加入3 mL超纯水，充分溶解，90 ℃油浴，180 r/min, 2 h。2)MES缓冲溶液(0.1 mol/L)的配制：0.97 g MES溶于50 mL超纯水中，用0.1 mol/L NaOH调节pH值到4.25～4.8。3)BSA空白纳米粒的合成：以1 mL体系为例，取25、50和100 μL活化后的BSA溶液(40 mg/mL),加入到24孔板中，然后加入975 μL MES溶液，在37 ℃,800 r/min振荡合成4 h。合成的纳米粒用100 ku的超滤管，4 000 r/min, 10 min 洗涤2～3次，4 ℃保存，备用。

1.2.3 Lir@BSA纳米粒的形成：

以1 mL体系为例，取25 μL活化后的BSA溶液(40 mg/mL),加入24孔板中，然后加入950 μL MES溶液，在震荡条件下加入25 μL Lir溶液，最后在37 ℃,800 r/min振荡合成4 h。合成的纳米粒用100 ku的超滤管，4 000 r/min, 10 min洗涤2～3次，最后用BCA蛋白试剂盒测定BSA蛋白浓度，4 ℃保存。

1.2.4 PMF浓度的测定：

用BCA蛋白试剂盒测定BSA蛋白浓度。

1.2.5 Lir@BSA-PMF纳米颗粒的制备：

配制1 mg/mL Lir@BSA溶液和1 mg/mL PMF溶液，按照体积比为1∶1混合，之后将上述混合液通过0.22 μm聚碳酸酯膜来回挤出20次，沉淀重悬备用。

1.2.6 透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM):

检测BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF微观形貌。

1.2.7 动态光散射(dynamic light scattering, DLS):

对比载药和包膜前后纳米颗粒的水合动力学直径和Zeta电位，判断血小板膜是否包覆在BSA表面。

1.2.8 酶联免疫吸附试验法：

利用利拉鲁肽检测试剂盒检测药物利拉鲁肽的包封率、负载率和Lir@BSA-PMF中药物利拉鲁肽的释放情况，具体方法如下：根据差量法测定负载率和包封率。将合成Lir@BSA-PMF过程中得到的滤液，用利拉鲁肽检测试剂盒(酶联免疫吸附试验法)检测滤液中Lir的含量，通过差量法计算负载率和包封率，公式如下：负载率(%)=(药总量-滤液中药含量)/(载体总量+药总量-滤液中药含量)×100%。包封率(%)=(药总量-滤液中药含量)/药总量×100%。释放率：将Lir@BSA-PMF纳米颗粒放在磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline, PBS)(pH=7.4)溶液中，37 ℃恒温箱中静置24 h, 在2、4、6、8、10、12和24 h时间点取出溶液，4 ℃保存。用试剂盒对不同时间点的溶液进行测定，利用累积法计算不同时间点Lir的释放量。

1.2.9 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析蛋白质结构：

为证明修饰的Lir@BSA-PMF具有完整的膜蛋白质，用RIPA裂解物裂解PMF和Lir@BSA-PMF并离心(14 000 r/min, 5 min)以获得提取的膜蛋白质，然后用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度。将样品与上样缓冲液混合并煮沸5 min。将PMF和Lir@BSA-PMF上样于15% SDS-PAGE胶(每孔35 μg)中，并在120 V下电泳1.7 h。然后将其用考马斯亮蓝染色60 min, 并采集结果。

1.2.10 CCK-8法检测细胞存活：

将BSA、PMF和Lir@BSA-PMF纳米溶液与HEK293T细胞在体外共培养，观察细胞的生存情况。HEK293T细胞在含有10%胎牛血清培养基中培养。取96孔板，每孔接种1×104个细胞，24 h后弃掉培养基，替换为纳米材料溶液，同时设置空白组，每组分别3个平行样品，置于培养箱中孵育24 h。分别在4、8、12、24、48和72 h后弃掉液体，每孔替换上100 μL培养基(含10 μL CCK-8溶液),继续在37 ℃,5% CO2的细胞培养箱中孵育2 h后，用酶标仪测量各孔在450 nm处吸光度(A450 nm)值。再根据公式：细胞存活率=(实验组吸光值/空白组吸光值)×100%,计算细胞存活率。

1.2.11 细胞内活性氧的检测：

使用二氯二氢荧光素二乙酸酯(2′7′-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)探针检测HEK293T细胞内ROS水平：将HEK293T细胞以1×104个细胞/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，37 ℃,5% CO2的潮湿培养箱中过夜贴壁培养。将HEK293T细胞用1 μg/mL的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)预先处理24 h造模。然后与 BSA、Lir、PMF和Lir@BSA-PMF纳米颗粒共孵育48 h, PBS洗涤细胞2次，每孔加入含10 μmol/L DCFH-DA探针的 PBS孵育48 h。通过激光共聚焦显微镜观察细胞的荧光强度。

1.2.12 细胞摄取实验检测对纳米颗粒摄取能力：

将HEK293T细胞(2×105个/孔)接种于24孔板中，与标记的纳米颗粒在37 ℃下分别孵育0、2、4、6和8 h。孵育结束后，弃药液，用PBS清洗2次，加入胰蛋白酶消化细胞，全培养基终止消化，收集细胞。接下来，为进一步研究细胞对Lir @BSA-PMF纳米系统的摄取，在预定时间内，用激光共聚焦显微镜对HEK293T细胞中FITC标记的NPs进行拍照。并用Imagine J软件对其荧光值进行半定量计算。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学处理，所有数据以均值±标准差表示，组间采用单因素方差分析和t检验。

2、结果

2.1 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的形貌观测

BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF组均为粒径大小均一的球状纳米粒子。单独的BSA纳米粒子的尺寸范围为25～35 nm, 而负载了药物Lir之后，其尺寸范围在35～50 nm。包裹了血小板膜的纳米粒子Lir@BSA-PMF中出现了很多纳米碎片，并且Lir@BSA-PMF的纳米尺寸范围为20～35 nm。

2.2 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的尺寸检测

单独的BSA水合动力学动力直径为28.2 nm, 而负载了药物之后，Lir@BSA粒径略微有增加，从28.2 nm增加到32.7 nm, 进一步包裹纳米血小板膜之后，Lir@BSA-PMF粒径值为26.2 nm(图2)。

2.3 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的Zeta电位测定

Lir与BSA纳米粒子复合之后，Zeta电位值发生改变，Lir@BSA纳米颗粒合成成功。包裹血小板膜之后，Lir@BSA-PMF的Zeta电位值进一步降低，血小板膜碎片成功包覆在Lir@BSA纳米颗粒表面，形成Lir@BSA-PMF仿生纳米载体(图3)。

2.4 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的粒径稳定性

Lir@BSA-PMF在PBS(pH=7.4)溶液中具有良好的稳定性，48 h内纳米粒子粒径维持在25 nm左右(图4)。

2.5 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的包封率和负载率

测试结果显示：Lir@BSA-PMF的包封率和负载率分别为85.56%和7.96%。

图1 BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF的透射电镜显微镜照片   

图2 BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF粒径分布   

图3 BSA、Lir、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF的 Zeta电位   

图4 Lir@BSA-PMF粒径稳定性   

2.6 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的释放率

Lir@BSA-PMF在PBS(pH=7.4)溶液中，24 h累计释放率为77.06%(图5)。

2.7 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体中完整膜蛋白质结构的验证

在PMF和Lir@BSA-PMF组中检测到相同的蛋白质条带分布，血小板膜在包覆药物Lir和BSA纳米颗粒之后，仍然保留着相似的膜蛋白质结构分布(图6)。

2.8 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的生物相容性验证

BSA、PMF和Lir@BSA-PMF组中加入纳米粒子后，各组HEK293T细胞存活率没有统计学显著性差异(图7)。

2.9 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体对细胞氧化损伤的影响

正常的HEK293T细胞的DCFH-DA荧光强度较低，用1 μg/mL LPS刺激之后，其荧光强度明显增加，成功构建氧化损伤模型。在体外HEK293T细胞的LPS模型中分别加入BSA、Lir、PMF和Lir@BSA-PMF纳米颗粒之后，BSA和PMF组的荧光强度与模型组基本一致，而Lir和Lir@BSA-PMF组的荧光强度逐渐减弱(图8A)。LPS刺激之后，与正常细胞相比，LPS模型组的荧光值显著增加(P<0.05),ROS损伤模型构建成功后，在LPS模型细胞中加入Lir和Lir@BSA-PMF纳米粒溶液后，与ROS损伤模型组相比，其荧光值显著性下降(P<0.05)(图8B)。

图5 Lir@BSA-PMF中Lir的释放效率  

图6 PMF和Lir@BSA-PMF的SDS-PAGE分析   

图7 CCK-8检测BSA、PMF and Lir@BSA-PMF HEK293T细胞活力的影响   

2.10 Lir@BSA-PMF仿生纳米载体的细胞吞噬效果

随着培养时间的延长，Lir@BSA-PMF纳米粒子在细胞中的绿色荧光强度逐渐增多(图9A)。随着时间的增加，细胞吞噬量逐渐增加(图9B)。

3、讨论

动脉粥样硬化是以斑块和炎症为特征的动脉血管疾病，高脂血症、高血压、炎性反应和氧化应激引起的慢性动脉损伤是导致其发生发展的主要原因[8]。目前该疾病主要的治疗方法是药物治疗。GLP-1在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)中具有特殊地位，因为它具有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素的能力[9]。GLP-1受体激动剂是对GLP-1结构进行修饰后获得，其半衰期进一步延长，外源性给药后可提高体内活性的GLP-1水平，使其在体内达到有效浓度，从而改善胰岛素敏感性，并发挥降低血糖、血压及体质量的作用[10]。本研究使用的药物利拉鲁肽作为GLP-1受体激动剂，是T2DM治疗领域的研究热点[11]。

图8 BSA、Lir、PMF和Lir@BSA-PMF对LPS诱导的HEK293T细胞氧化损伤的影响   

图9 Lir@BSA-PMF纳米颗粒的细胞吞噬效果  

近期研究结果显示将药物与纳米粒子结合起来形成纳米载药，可降低药物毒性以及增加在特定部位的富集，利于动脉粥样硬化的治疗[12]。本研究使用的BSA纳米载体是牛血清中的一种球蛋白，实验结果显示BSA、PMF和Lir@BSA-PMF本身对HEK293T细胞均无杀伤能力，Lir@BSA-PMF稳定规则的纳米球状结构可被细胞摄取。相比于单独的纳米颗粒，包裹血小板膜碎片的纳米颗粒尺寸有轻微减小，且粒径分布变宽，这可能与Lir@BSA-PMF的制备过程中来回挤出有关。在来回挤出的过程中纳米颗粒形状变得更加规整，同时也可能会出现部分纳米颗粒被挤碎的现象。

药物递送过程中的生物屏障可阻止纳米药物载体在患病部位的积累，从而会限制药物治疗时的有效率[13]。另外有研究表明，血小板可通过诱导单核细胞迁移富集到动脉粥样硬化斑块上[14]。本研究使用血小板膜片对纳米颗粒进行修饰，制备的仿生纳米药物递送系统是由血小板膜伪装成的纳米颗粒，更加容易在复杂的生物环境中运行[15];纳米颗粒表面保留的膜蛋白质结构可延长其在血液中的循环，同时具有靶向斑块递送以及受控释放的特点。本研究结果显示Lir@BSA-PMF载药纳米仿生载体24 h内可持续缓慢释放药物利拉鲁肽。

综上所述，本研究制备的Lir@BSA-PMF载药纳米仿生载体具有良好的生物相容性和抗氧化损伤能力，具备优异的药物包封率和药物缓释效果，同时可被细胞摄取并且保留了血小板膜上的蛋白质。

参考文献:

[2]李沛城,冯波.利拉鲁肽下调糖尿病 ApoE-/小鼠主动脉糖基化终产物受体表达并减轻动脉粥样硬化[J].中华内分泌代谢杂志,2016,32:680-684.

[6]郭方君,杨人强.血小板微粒促进动脉粥样硬化发生的研究进展[J].基础医学与临床,2020,40:1551-1555.

[9]张文婷,王瑾,岳继萍,等.硫氧还蛋白相互作用蛋白降低GLP-1促小鼠胰岛β细胞的增殖效应[J].基础医学与临床,2020,40:1076-1082.

[10]刘东华,荆凡波,全香花,等.基因多态性与胰高血糖素样肽1受体激动剂疗效的相关性研究进展[J].中国药房,2020,31:245-250.

[12]刘滔滔,李天容,王雪,等.纳米颗粒和外泌体靶向载药系统诊治动脉粥样硬化的机遇与挑战[J].中国全科医学,2023,26:903-910.

文章来源:黄清昱,陈奇英,孙晟甲等.Lir@BSA-PMF纳米颗粒的制备及其细胞功能验证[J].基础医学与临床,2024,44(02):235-241.