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改良腹主动脉缩窄法建立心肌肥厚模型

2024-02-06 141 上传者：管理员

摘要：目的通过不同方法缩窄大鼠腹主动脉，比较构建心肌肥厚模型，探讨改良腹主动脉缩窄法(AAC)较传统AAC的优势。方法实验大鼠45只，分3组，每组15只。假手术组，在左肾上方分离腹主动脉，不做处理；传统组，经腹正中线切口缩窄腹主动脉直径至0.70 mm,持续4周；改良组，在左肾上方缩窄腹主动脉直径至0.45 mm,持续1周。术后测量大鼠收缩末期室间隔厚度(IVSs)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWs)。取心脏标本测量心脏指数(HW/BW)及左心室指数(LVW/BW);经HE染色、Masson染色的病理切片，测量心肌细胞横截面积、心肌胶原面积及心肌胶原面积分数。Western blotting检测脑钠肽(BNP)表达水平。结果相比假手术组，改良组和传统组大鼠IVSs、LVPWs、心脏指数、左心室指数、心肌细胞横截面积、心肌胶原面积、心肌胶原面积分数和BNP表达水平差异均显著(P<0.05)。在改良组和传统组组间，这些指标差异无统计学意义。结论与传统方法相比，改良腹主动脉缩窄法用时短，稳定，模型均一，易复制，心肌肥厚相关指标水平表型相似，可作为建立压力负荷性心肌肥厚模型更为理想的术式。

关键词：
POMH
免疫印迹法
心肌肥厚
改良腹主动脉缩窄法
超声心动图
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心肌肥厚是充血性心力衰竭和死亡的主要危险因素。压力负荷性心肌肥厚(pressure-overload myocardial hypertrophy, POMH)在早期可以代偿增加的室壁应力，但随着心肌肥大进一步发展，即使室壁应力正常，也不能阻止心脏功能进行性恶化和左心室失代偿[1]。所以，及时防治心肌肥厚可以降低心力衰竭发生率和死亡率[2]。

为了研究心肌肥厚病理生理过程、分子生物学机制及相关药物开发，建立合适的心肌肥厚模型具有重要意义。目前，大鼠心肌肥厚模型尚无统一标准。因为诱导方式的差异，不同课题组建立的心肌肥厚模型表型的一致性差，数据离散程度大[3]。现在的研究者多采用传统的腹主动脉缩窄法(abdominal aortic coarctation, AAC),经腹部正中切口，缩窄腹主动脉至0.7 mm, 需要4周，创伤大，操作复杂，用时较长[4,5]。Massart等[6]缩窄腹主动脉至0.5 mm, 可建立高血压心肌肥厚模型。基于此，本实验进一步通过腹膜后位进行手术操作，在左肾上方缩窄腹主动脉至0.45 mm, 持续1周，建立大鼠POMH模型，通过观察心脏结构和功能、心肌组织形态学、心肌肥厚标志物等，探讨改良腹主动脉缩窄法的优势，为研究者探寻更理想的心肌肥厚模型提供参考。

一、材料和方法

1. 实验动物

10周龄雄性SPF级SD大鼠45只，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，生产许可证号： SCXK(京) 2017-0005,体重(230±10) g。饲养温度21～25 ℃,湿度50%～70%,实验由包头医学院医学伦理审查委员会批准(包医伦审2022第52号)。大鼠在包头医学院动物实验中心适应性喂养1周后，按照随机数字表将大鼠随机分为3 组，每组15只：假手术组，只分离出腹主动脉而不做缩窄处理；改良组，左肾上方缩窄腹主动脉直径至 0.45 mm, 1周后解除缩窄；传统组，经腹正中切口缩窄腹主动脉直径至 0.70 mm, 4周后解除缩窄。

2. 改良术式与传统术式构建心肌肥厚模型

2.1 改良术式：

大鼠术前禁食12 h, 10% 水合氯醛溶液(2 ml/kg) 腹腔注射麻醉，待夹尾反射消失后，右侧卧位固定大鼠于手术台。以左肾在左髂腰区体表投影的正中点为中心备皮，碘伏消毒，2～3 cm 纵行切口，纵向切开皮肤，钝性分离结缔组织、筋膜，从腹膜后位暴露左肾，轻柔撕开肾脂肪囊，暴露左肾及腹主动脉，在腹主动脉发出肾动脉分支点上方约 3 mm 处分离出腹主动脉，并在其后方穿3#缝线备用。改良组将 0.45 mm 外径注射器针头(尖端已做钝化处理)与腹主动脉紧贴，平行放置，缝线将腹主动脉与注射器针头结扎紧后，可见肾脏缺血变白，随即小心取出针头，造成腹主动脉部分狭窄(缩窄点处恢复再通的内径即为注射器针头的外径)。腹腔用温盐水冲洗后撒入青霉素 8×106 IU/kg, 还纳肾脏，小心缝合切口。假手术组分离腹主动脉后穿3#缝线，不结扎。

2.2 传统术式：

麻醉大鼠仰卧位固定，沿腹部中线于剑突下作3 ～4 cm切口，牵开腹腔脏器暴露腹主动脉，在腹主动脉发出左肾动脉分支点上方3 mm处，将 0.7 mm 外径注射器针头(尖端已做钝化处理)与腹主动脉紧贴，平行放置，其他同改良组。改良组术后1周取出腹主动脉缝线，解除狭窄。传统组狭窄持续4周。

3. 经胸超声心动检测

3组大鼠于模型制作后第4周经胸骨旁左室长轴切面分别行超声心动图检测，使用高频探头取胸骨旁左室长轴切面，由二维超声引导进行测量。测量指标包括：收缩末期室间隔厚度(end-systolic interventricular septum thickness, IVSs)和收缩末期左室后壁厚度(left ventricular end-systolic posterior wall thickness, LVPWs) 。每只大鼠均测定8个心动周期并计算平均值。

4. 心脏指数及左心室质量指数测量

剪去心脏周围组织，游离出左心室，包括室间隔，生理盐水冲洗后滤纸吸干水分，电子天平称取全心质量(heart weight, HW)、左心室质量(left rentricular weight, LVW)和体质量(body weight, BW),计算心脏指数(HW/BW)(g/kg),左心室指数(LVW/BW)(g/kg)。

5. 心肌组织形态学检测

沿左心室长轴垂直的方向切断左心室，留取包括心尖的左心室部分，常规石蜡切片，厚3～5μm, HE染色和Masson染色，日本Olympus病理显微成像系统采集图片，要求图片中待测的细胞规则，边缘清晰，细胞核明显。Image J 2.1.0分析软件，依据HE染色图像，随机选取5个细胞测量心肌细胞横截面积，依据Masson染色图像，测定蓝色胶原纤维面积及组织总面积，计算得到心肌胶原面积、心肌胶原面积分数(心肌胶原面积/视野面积)。

6. 心肌组织中脑钠肽的表达水平

采用Western blotting法检测各组大鼠心肌组织中脑钠肽 (brain natriuretic peptide, BNP)蛋白(SAB 兔来源 1∶1000)的相对表达量。内参蛋白采用β-actin(SAB 兔来源 1∶5000),使用Image J 2.1.0软件分析条带的灰度值。

7. 统计学方法

采用GraphPad Prism 9.4.1 统计学软件进行数据分析，对于符合正态分布的测量数据，采用均值±标准误表示，单因素方差分析(One-Way ANOVA)用于多组间比较，独立样本t检验用于两组间比较；不符合正态分布的数据采用两独立样本秩和检验，检验标准为α=0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。图表均采用GraphPad Prism 9.4.1 软件制作。

二、结果

1. 存活率及一般情况的比较

术后假手术组大鼠存活率100%(15/15),改良组成活率86.7%(13/15),传统组成活率66.7%(10/15)。与假手术组相比，行传统AAC的大鼠术后均表现易怒，易激惹，脱毛，活动能力下降，对外界刺激反应强烈，体重增长较缓慢。饮食、饮水无明显区别。

图1 假手术组、改良组和传统组大鼠超声心动图、组织病理学结果标尺示100 μm

2. 超声心动图检查结果

与假手术组相比，改良组和传统组IVSs、LVPWs均明显增厚，差异有统计学意义。其中，IVSs中假手术组vs 改良组，P<0.05,假手术组vs传统组 P<0.01;LVPWs中假手术组vs 改良组，P<0.01;假手术组vs传统组 P<0.01。改良组和传统组相比，IVSs、LVPWs无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05,图1A～1C,2A,2B)。

3. 心脏指数和左心室指数结果

与假手术组相比，改良组和传统组心脏指数(HW/BW)、左心室指数(LVW/BW)均明显变大，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.0001)。改良组和传统组相比，HW/BW、LVW/BW无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05,图2C,2D)。

4. 组织病理学结果

HE和Masson染色从组织形态学和心肌细胞显微结构反映大鼠心肌肥厚表型。假手术组心肌细胞排列整齐，肌纤维纹理清晰，染色均匀。改良组和传统组光学显微镜下表现相似，心肌纤维变粗，排列紊乱，间隙增宽，染色不均，心肌细胞肥大，间质增生，细胞部分水肿，细胞核固缩，深染，间质纤维组织增生，伴有炎症细胞浸润(图1D～1I)。相比假手术组，改良组和传统组心肌细胞横截面积显著增大，差异有统计学意义(P<0.0001)。改良组和传统组相比，心肌细胞横截面积差异无统计学意义(P>0.05,图3A)。

相比假手术组，改良组和传统组心肌胶原面积、心肌胶原面积分数显著增大，差异有统计学意义(P<0.01)。改良组和传统组相比，心肌胶原面积、心肌胶原面积分数无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05, 图3B,3C)。

5. 心肌组织中BNP蛋白表达水平

BNP是评价心肌肥厚模型的重要指标[7]。与假手术组相比，改良组、传统组BNP蛋白表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。与改良组相比，传统组BNP蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05,图3D,3E)。

图2 假手术组、改良组和传统组超声心动图(A、B)、心脏指数(C)和左心室指数(D)结果

图3 假手术组、改良组和传统组心脏组织病理学、BNP蛋白相对表达量

三、讨论

本实验中相比假手术组，改良组和传统组的心脏指数、左心室指数、心肌细胞横截面积、心肌胶原面积、心肌胶原面积分数、收缩末期室间隔厚度、收缩末期左室后壁厚度和心肌肥厚标志物BNP差异均显著，说明改良组和传统组腹主动脉缩窄后的大鼠发生了心室重构和心肌肥厚。这些反映心室重构和心肌肥厚的指标在改良组和传统组组间未见明显变化。说明改良术式和传统术式对于构建大鼠心肌肥厚模型有着相同效果，所建立的大鼠模型同样具有典型的心肌肥厚表型。

术后假手术组大鼠存活率100%(15/15),改良组成活率86.7%(13/15),传统组成活率66.7%(10/15),说明改良腹主动脉缩窄法可提高模型成活率。本实验中，传统术式存活率低，是因为传统术式创伤大，操作复杂且存在诸多问题。传统的腹主动脉缩窄法在腹部正中剑突下作一纵行切口，入腹腔后牵开腹腔脏器，暴露腹主动脉，存在诸多弊端[8],包括：1.术毕还纳腹腔脏器时，易造成肠道扭转，导致术后肠梗阻；2.牵拉腹腔脏器时，易导致肝脏撕裂和胆管破裂；3.分离腹主动脉时易造成下腔静脉及其属支的损伤。为避免传统术式的弊端，我们的改良腹主动脉缩窄法通过腹膜后位进行手术操作，避免损伤腹膜及腹腔脏器，可带来一定的存活率获益。

改良AAC通过机械性狭窄，造成心脏射血后负荷的增加，形成相对稳定的POMH,可以模拟血流动力学因素(如高血压、主动脉瓣狭窄)在心肌肥厚发展过程中的作用，能较快形成左心室肥厚、与临床相关性好，所产生的心肌肥厚的组织形态和异常代谢与人类相似[9]。改良AAC有利于研究者独立地探究血流动力学因素对心肌肥厚的影响，是研究心肌肥厚病理生理过程、分子生物学机制及相关药物较理想的动物模型。

传统的腹主动脉缩窄法[10,11]采用腹部正中切口，腹主动脉缩窄至0.7 mm, 持续4周，本实验的改良腹主动脉缩窄法通过腹膜后位进行手术操作，腹主动脉缩窄至0.45 mm, 1周后可得到相同表型的压力负荷性心肌肥厚模型。相较传统术式，本模型构建用时较短，对大鼠生理功能损伤小，操作简单，方法先进，模型稳定、易复制，成活率高。可作为建立压力负荷性心肌肥厚模型更为理想的术式。

基金资助:内蒙古自治区自然科学基金(2021MS08002);

文章来源:郝永明,郭磊,周程辉等.改良腹主动脉缩窄法建立心肌肥厚模型[J].解剖学报,2024,55(01):120-124.