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右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠的保护作用

2024-02-27 52 上传者：管理员

摘要：目的探讨右美托咪定预处理对心肌缺血再灌注小鼠的保护作用及Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎性信号通路的影响。方法将C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(只穿线不结扎)、模型组(结扎冠状动脉左前降支后恢复)、阳性对照组(腹腔注射1 mg·kg-1的曲美他嗪后建模)、右美托咪定组(腹腔注射20μg·kg-1的右美托咪定后建模)、抑制药组(腹腔注射10 mg·kg-1的NLRP3抑制药MCC950后建模),每组12只。再灌注24 h后进行心功能指标检测，用蛋白质印迹法检测心肌组织相关蛋白表达水平，用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测各组小鼠血清因子表达水平，用试剂盒法检测心肌组织抗氧化指标水平，用Tunel法检测各组细胞凋亡水平。结果假手术组、模型组、阳性对照组、右美托咪定组、抑制药组心肌组织NLRP3蛋白表达水平分别为0.31±0.05、1.06±0.07、0.52±0.05、0.65±0.07和0.39±0.04;凋亡相关颗粒样蛋白(ASC)表达水平分别为0.27±0.08、0.88±0.09、0.46±0.05、0.59±0.07和0.34±0.04;肌酸激脢同工酶(CK-MB)水平分别为(25.64±2.94)、(102.08±7.04)、(49.61±7.70)、(60.86±5.24)和(63.24±5.38)U·L-1;白细胞介素-6(IL-6)水平分别为(104.78±10.73)、(231.54±15.56)、(158.20±16.54)、(165.10±14.77)和(141.17±14.08)pg·mL-1;Tunel阳性细胞率分别为(4.34±0.16)%、(25.98±1.58)%、(8.74±0.93)%、(11.06±1.07)%和(9.19±0.88)%。模型组与假手术组比较，右美托咪定组、抑制药组分别与模型组比较，上述指标在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论右美托咪定预处理可能通过抑制NLRP3/ASC/caspase-1炎性通路，抑制炎性反应和心肌细胞凋亡预防缺血再灌注心肌损伤。

关键词：
Nod样受体蛋白3/凋亡相关颗粒样蛋白/胱天蛋白酶-1通路
右美托咪定
心功能
心肌缺血再灌注
炎性反应
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急性心肌梗死和相关心力衰竭是全世界范围内死亡和残疾的主要原因，使用直接经皮冠状动脉介入法及时进行心肌再灌注是最有效的治疗方法，然而心肌再灌注过程本身就可诱发心肌细胞死亡和心肌损伤[1,2]。右美托咪定作为一种α-2肾上腺素能受体激动药，具有镇痛和镇静的作用，右美托咪定还具有保护心脏的功能，动物实验表明右美托咪定预处理可预防缺血再灌注心肌损伤[3]。Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体作为炎症反应中的重要因子已被证实参与心肌缺血再灌注损伤的发展过程[4]。本研究将通过构建心肌缺血再灌注小鼠模型，探究右美托咪定预防心肌缺血再灌注的潜在机制。

一、材料与方法

1 材料

动物

7～8周龄的SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量为18～24 g, 购自新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心，动物生产许可证号：SCXK(新)2021-0001。本实验经新疆医科大学附属第一医院伦理委员会批准(批号：220414-133)。

药品与试剂

右美托咪定注射液，规格：每支1 mL/0.1 mg, 批号：20230324,批准文号：国药准字H20183220,扬子江药业集团有限公司生产；NLRP3抑制药MCC950,规格：每支5 mg, 批号：20230118,北京百奥莱博科技有限公司生产。NLRP3、凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis-associated granuloid proteins, ASC)、胱天蛋白酶-1(cysteine aspartate specific proteinase-1,caspase-1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved cysteine aspartate proteinase-3,cleaved caspase-3)一抗，均为英国Abcam公司生产；心肌损伤标志物肌钙蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ,cTnⅠ)试剂盒、肌酸激脢同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)试剂盒，均由上海梵态生物科技有限公司生产；小鼠乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)试剂盒，武汉菲越生物科技有限公司生产；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)试剂盒，均由上海联迈生物工程有限公司生产；Tunel染色试剂盒，上海碧云天公司生产；总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所生产。

仪器

VEVO 310小动物超声影像系统，加拿大富士VisualSonics产品；SpectraMax i3x多功能酶标仪，奥地利美谷分子仪器公司产品；Revolve Generation 2荧光显微镜，美国Echo公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[5]5]

心肌缺血再灌注小鼠损伤模型的构建在无菌条件下进行，随机选取12只小鼠为假手术组小鼠，其余小鼠均进行造模，用戊巴比妥钠(0.5%,50 mg·kg-1)对小鼠麻醉，并连接心电图和呼吸机，将小鼠胸部消毒并将毛发剔除干净。然后从左边依次打开皮肤及肌肉组织并暴露心脏，打开心包，使用缝合线从小鼠冠状动脉左前降支下方穿出并收缩手术结，然后观察小鼠心脏缺血部位逐渐发白，并观察心电图显示ST段抬高，说明缺血模型构建成功，在结扎45 min后解除结扎线并恢复供血再灌注2 h, 心前区逐渐变为红色后说明再灌注成功。其中假手术组只穿线不结扎。

2.2 动物分组与处理[6]6]

将小鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、右美托咪定组、抑制药组，每组12只，假手术组和模型组小鼠均按照“2.1”方法进行建模。阳性对照组小鼠在缺血前腹腔注射1 mg·kg-1曲美他嗪后进行建模，右美托咪定在缺血前腹腔注射20 μg·kg-1右美托咪定后进行建模，抑制药组小鼠在缺血前14 h和2 h分别腹腔注射10 mg·kg-1的NLRP3抑制药MCC950后进行建模。所有小鼠在再灌注24 h后进行心功能指标检测，然后腹主动脉采血后处死小鼠取心肌组织进行后续检测。

2.3 心功能指标的检测[6]6]

再灌注24 h后将小鼠取仰卧位固定，用小动物超声影像系统对所有小鼠心功能相关指标进行检测，将导管经颈动脉插入左心室分别检测左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、射血分数(ejection fraction, EF)、缩短分数(fractional shortening, FS)。

2.4 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达水平[7]7]

收集各组小鼠心肌组织，加入放射免疫沉淀裂解液充分裂解后提取总蛋白，用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度，然后取蛋白样品50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳，以GAPDH为内参进行灰度值分析。

2.5 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测各组小鼠血清因子水平[8]8]

腹主动脉采血后，4 ℃下以3 000 r·min-1离心15 min后收集血清，然后分别按照ELISA试剂盒操作说明进行检测血清CK-MB、LDH、cTnⅠ及炎性因子IL-6、IL-1β、IL-10含量。

2.6 试剂盒法检测心肌组织抗氧化指标水平[9]9]

收集各组小鼠心肌组织，称重后根据心肌组织质量按照体积比1∶9加入0.9%NaCl并剪碎组织制备组织匀浆(10%),然后以3 000 r·min-1离心10 min后收集上清液，并用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，根据试剂盒操作步骤检测心肌组织中抗氧化指标T-SOD和GSH-Px水平。

2.7 Tunel法检测各组细胞凋亡水平[10]10]

收集各组小鼠心肌组织进行常规石蜡切片后，组织切片用蛋白酶K在37 ℃下孵育20 min, 然后用磷酸盐缓冲液洗涤，接下来切片与Tunel工作缓冲液在37 ℃下孵育60 min, 并进一步用二脒基苯基吲哚染色液进行核染色(蓝色荧光)。最后用荧光显微镜观察。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。符合正态分布的数据用表示，组间比较用One-way ANOVA法分析，2组间比较用独立样本t检验。

二、结果

1 右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠心肌组织NLRP3/ASC/caspase-1通路的影响

假手术组只穿线不结扎，模型组(结扎冠状动脉左前降支后恢复，阳性对照组腹腔注射1 mg·kg-1曲美他嗪后建模，右美托咪定组腹腔注射20 μg·kg-1的右美托咪定后建模，抑制药组腹腔注射10 mg·kg-1 NLRP3抑制药MCC950后建模。

与假手术组比较，模型组小鼠心肌组织中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组、右美托咪定组及抑制药组NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平均显著降低(均P<0.05),见表1。

2 右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠心功能的影响

与假手术组比较，模型组小鼠心功能指标LVESD和LVEDD均显著升高(均P<0.05),EF和FS值均显著降低(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组、右美托咪定组及抑制药组LVESD和LVEDD均显著降低(均P<0.05),EF和FS值均显著升高(均P<0.05),见表2。

3 右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠心肌酶指标的影响

与假手术组比较，模型组小鼠血清中CK-MB、LDH和cTnⅠ水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组、右美托咪定组及抑制药组CK-MB、LDH和cTnⅠ水平均显著降低(均P<0.05),见表3。

表1 各组小鼠心肌组织NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表达水平比较

表2 各组小鼠心功能指标的比较

表3 各组小鼠血清CK-MB、LDH和cTnⅠ水平的比较

表4 各组小鼠血清IL-6、IL-1β、IL-10水平和心肌组织T-SOD、GSH-Px水平的比较

4 右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠炎性因子及氧化指标的影响

如表4所示，与假手术组比较，模型组小鼠血清促炎因子IL-6、IL-1β水平均显著升高(均P<0.05),血清IL-10及心肌组织抗氧化酶T-SOD、GSH-Px含量均显著降低(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组、右美托咪定组及抑制药组血清促炎因子IL-6、IL-1β水平均显著降低(均P<0.05),IL-10及心肌组织抗氧化酶T-SOD、GSH-Px值均显著升高(均P<0.05)。

图1 以蛋白质印迹法检测Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3蛋白水平下

表5 各组小鼠心肌细胞凋亡和凋亡蛋白表达的比较

5 右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠心肌组织心肌细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组小鼠心肌组织心肌细胞Tunel凋亡率及Bax/Bcl-2、cleaved-caspase-3水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组、右美托咪定组及抑制药组心肌细胞Tunel凋亡率及Bax/Bcl-2、cleaved-caspase-3水平均显著降低(均P<0.05),见图1和表5。

三、讨论

本研究结果表明，在模型小鼠中NLRP3/ASC/caspase-1通路被激活。此外本研究还观察到右美托咪定预处理以及NLRP3抑制药处理后，小鼠心肌组织中NLRP3、ASC及caspase-1蛋白水平均显著下降，提示右美托咪定可能通过调控NLRP3通路预防缺血再灌注心肌损伤。

本研究中，模型组小鼠血清中IL-6、IL-1β表达升高，IL-10水平明显下降，而右美托咪定及NLRP3抑制药处理后，模型小鼠血清中IL-6和IL-1β水平均明显下降，IL-10水平上升，同时右美托咪定及NLRP3抑制药处理后小鼠心功能指标均得到明显改善，且心肌损伤指标血清CK-MB、LDH和cTnⅠ水平及心肌细胞凋亡率、促凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、cleaved-caspase-3水平均明显下降，结果均提示预处理右美托咪定可能通过抑制NLRP3/ASC/caspase-1通路减轻炎性反应进而预防再灌注后心肌损伤。

本研究中，右美托咪定和NLRP3抑制药预处理后，小鼠心肌组织中T-SOD、GSH-Px水平较模型组均明显升高，提示右美托咪定可能通过介导NLRP3/ASC/caspase-1通路抑制氧化应激预防缺血再灌注小鼠心肌损伤。

参考文献:

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基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2019D01C324);

文章来源:胡振飞,黄一丹,戴晓雯.右美托咪定对心肌缺血再灌注小鼠的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(04):574-578.