急性心肌缺血（acute myocardial ischemia,AMI）是由于冠状动脉粥样硬化堵塞或痉挛导致心肌损伤的心血管疾病，其发病率和病死率在我国逐年上升，严重影响患者生命健康[1,2]。

自主神经系统作为大脑与外周重要脏器沟通交互的关键途径，在神经免疫和心血管相互作用中发挥决定作用。有研究发现，交感神经活动异常是AMI的关键机制，调控交感神经活动可改善AMI心功能障碍[3]。谷氨酸（Glu）是一种兴奋性神经递质，细胞间隙中Glu过量将引发神经毒性反应，导致神经元退化、衰老及死亡[4]。谷氨酸能神经元作为中枢核团的兴奋性神经元，与交感神经活动密切相关[5]。抑制下丘脑室旁核谷氨酸能神经元兴奋可减轻心肌缺血再灌注损伤[6]。课题组前期研究表明，针刺心经穴能抑制心肌缺血大鼠海马去甲肾上腺素神经递质过度释放介导的交感神经亢进，从而改善心功能障碍[7]。但针刺是否通过调控海马谷氨酸能神经元兴奋性改善心肌缺血损伤目前尚不清楚。本实验观察电针心经穴对AMI大鼠心功能及海马组织Glu、代谢型谷氨酸受体2/3(m Glu R2/3）和PI3K信号通路蛋白表达的影响，探讨电针心经穴对AMI大鼠脑损伤的保护机制。

1、材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠50只，体质量（200±10)g，安徽省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK（皖）2017-001，饲养于安徽中医药大学新安医学重点实验室动物房，温度21～25℃，湿度52%～55%，自然光照。实验过程中对动物的处理严格遵循《关于善待实验动物的指导性意见》，并经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审批（AHUCM-Rats-2021122）。

1.2 主要试剂及仪器

异氟烷（货号R510-22，深圳瑞沃德），胱天蛋白酶-3(Caspase-3）活性检测试剂盒（货号C1115，上海碧云天），Glu试剂盒（货号MM-0601R2，江苏酶免实业有限公司），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（货号C1086，上海碧云天公司），m Glu R2/3抗体（货号ab283572，英国Abcam公司），山羊抗兔Ig G（货号A0423，上海碧云天公司），Caspase-3抗体（货号ab184787，英国Abcam公司），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗体（货号ab191606，英国Abcam公司），蛋白激酶B(Akt）抗体（货号ab179463，英国Abcam公司），GAPDH抗体（货号K106389P，北京Solarbio公司）。

R500小动物吸入麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司），Powerlab 16导生理记录仪（澳大利亚AD instruments公司），华佗牌SDZ-Ⅴ型电针治疗仪（苏州医疗用品厂），0.25 mm×25 mm一次性无菌针灸针（天津亿朋医疗器械有限公司），ECLIPSE Ni型荧光显微镜（日本Nikon公司）；SQ2125型石蜡切片机（德国徕卡公司），Mini protean 3 cell电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 造模及分组

大鼠适应性喂养1周后，随机选取10只作为假手术组，其余40只参照文献[8]建立AMI模型。大鼠吸入2%异氟烷麻醉，仰卧位固定于鼠板，连接Powerlab 16导生理记录仪记录心电图。于大鼠左胸部剃毛消毒，逐层切开皮肤、皮下组织至胸大肌，充分暴露心脏，用6/0缝线结扎左冠状动脉前降支，迅速回纳心脏，关闭胸腔，缝合皮肤。以心电图ST段抬高≥0.1 m V、T波高耸或倒置为造模成功标准。假手术组仅开胸穿线，不结扎。术中死亡7只，造模后死亡3只，将30只造模成功大鼠按随机数字表法分为模型组、电针组和抑制剂组，每组10只。

1.4 干预

电针组造模后1 d开始干预，参照大鼠穴位图谱取穴定位，参照课题组既往研究和相关文献[9]，选取双侧“神门”“通里”直刺1 mm，连接电针仪，疏密波，频率2/15 Hz,30 min/次，连续3 d。抑制剂组于造模后30 min经侧脑室注射LY341459抑制剂。大鼠吸入2%异氟烷麻醉，将头固定于脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱定位侧脑室（前囟后0.8 mm、左侧旁开1.5 mm），标记后用颅骨钻打孔，用10μL微量进样器自颅骨表面垂直进针4.0 mm，注射5 mg/m L LY341459溶液（溶于DMSO)8μL,8 min内注射完毕，留针2 min，缓慢退针，缝合头皮并消毒。假手术组、模型组和抑制剂组不予电针治疗，每日抓取固定相同时间。

1.5 指标检测

1.5.1 HE染色

干预结束后，1%戊巴比妥钠腹腔注射（50 m L/kg）麻醉大鼠，摘取心脏，取部分心肌组织置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，二甲苯和无水乙醇脱蜡、水化，苏木精染色，分化、返蓝，伊红染色后封片，置于显微镜下观察并采集图像。

1.5.2 ELISA检测

大鼠麻醉后快速断头，剥离脑组织，剪取海马组织。取适量心肌和海马组织，剪碎后加入PBS溶液研磨，匀浆，4℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液，严格按试剂盒说明书操作，酶标仪波长450 nm检测各孔吸光度（OD值），根据标准曲线计算心肌组织Caspase-3活性和海马组织Glu含量。

1.5.3 免疫荧光染色

海马组织置于4%多聚甲醛中固定，逐级脱水、石蜡包埋后，制成厚度约4μm切片，常规脱蜡，经抗原修复后滴加m Glu R2/3一抗（1∶200),4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，滴加二抗（1∶500),37℃避光孵育30 min,PBS洗涤3次，DAPI染液封片，荧光显微镜下观察，每张切片随机选取3个视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件统计阳性表达的平均荧光强度。

1.5.4 TUNEL染色

海马组织切片常规脱蜡，滴加蛋白酶K作用30 min,PBS洗涤3次，每个样本滴加TUNEL检测液50μL(Td T酶5μL+荧光标记液45μL），孵育2 h,PBS冲洗，DAPI封片。荧光显微镜下观察，每张切片随机选取3个视野，TUNEL染色阳性为凋亡细胞，用ImagePro Plus 6.0软件分析阳性细胞数。

1.5.5 Western blot检测

取海马组织50 mg，加入RIPA裂解液200μL提取蛋白，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入5×SDS-PAGE loading buffer煮沸10 min使蛋白变性，冷却后上样，凝胶电泳分离蛋白，转膜，冲洗封闭，加PI3K、Akt、Caspase-3一抗（1∶2 000),4℃孵育过夜，TBST洗膜，常温孵育二抗，洗膜，滴加ECL显影，凝胶成像系统成像，Image J软件进行灰度分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Tamhane's T2法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 电针对模型大鼠心肌组织形态的影响

假手术组大鼠心肌细胞形态结构较完整、排列整齐，未见明显改变；模型组大鼠心肌细胞疏松、肿胀，炎性细胞浸润严重；电针组和抑制剂组大鼠心肌细胞水肿减轻，炎性细胞浸润减少。见图1。

2.2 电针对模型大鼠心肌组织胱天蛋白酶-3活性和海马组织谷氨酸含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Caspase-3活性显著升高，海马组织Glu含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，电针组和抑制剂组大鼠心肌组织Caspase-3活性显著降低，海马组织Glu含量显著减少（P<0.01）。电针组与抑制剂组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

图1 各组大鼠心肌组织形态（HE染色）  

图2 各组大鼠心肌组织Casepase-3活性和海马组织Glu含量比较（±s，每组6只）   

2.3 电针对模型大鼠海马组织代谢型谷氨酸受体2/3阳性表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织m Glu R2/3阳性表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，电针组和抑制剂组海马组织m Glu R2/3阳性表达显著降低（P<0.01）。电针组与抑制剂组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.4 电针对模型大鼠海马组织细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织凋亡细胞数显著增加（P<0.01）；与模型组比较，电针组与抑制剂组海马组织凋亡细胞数显著减少（P<0.01）。电针组和抑制剂组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

图3 各组大鼠海马组织m Glu R2/3阳性表达比较（免疫荧光染色，×200,±s，每组4只）  

图4 各组大鼠海马组织凋亡细胞数比较（TUNEL染色，±s，每组4只）  

2.5 电针对模型大鼠海马组织磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B、胱天蛋白酶-3蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠海马组织PI3K、Akt蛋白表达显著降低，Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，电针组和抑制剂组大鼠海马组织PI3K、Akt蛋白表达显著升高，Caspase-3蛋白表达显著降低（P<0.01）。电针组与抑制剂组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图5。

图5 各组大鼠海马组织PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表达比较（±s，每组4只）

3、讨论

《素问·灵兰秘典论篇》载“心者，君主之官，神明出焉”。心与脑在生理和病理上密切相关，且在结构上经络相通[10]。AMI后，血脉无主，气血失和，神无所附则心伤神损，心脑共病[11]。其病位在心，故选取心经神门、通里为治疗点，起到调心安神、通经活血、心脑同治作用。本实验结果显示，模型组大鼠心肌细胞疏松、肿胀，炎性细胞浸润严重，心肌组织Caspase-3活性显著升高，而电针可减轻心肌细胞病理改变，降低心肌组织Caspase-3活性，提示电针能改善心肌缺血损伤，与既往研究结果[12,13]一致。

自主神经系统结构损伤和支配紊乱与AMI密切相关[14]。心肌缺血缺氧刺激心室壁机械、化学感受器，通过心反射活动导致心脏自主神经失衡[15]。海马作为边缘系统核团之一，与心血管活动密切相关[7,16]。前期研究显示，针刺心经通过自下而上传入并表征于海马、室旁核、孤束核、蓝斑核等核团，经中枢汇聚整合后，再输出于心脏，从而实现对心功能的调节[17,18]。过量Glu诱导海马兴奋性毒性[19]，从而增加交感神经和下丘脑-垂体-肾上腺轴兴奋性，实现对自主神经系统和神经内分泌系统的调控[20,21]。因此，探索海马Glu系统在心肌缺血损伤中的作用尤为重要。

Glu是一种在中枢神经系统分布最多的兴奋性神经递质，在调节神经传递、影响突触可塑性和递质释放中起重要作用[22]。Glu受体在脑内分布广泛，其中m Glu R2/3位于众多信号通路的上游，能抑制突触前神经末梢释放Glu[23,24]。活化的m Glu R2/3通过激活ERK、PI3K、NF-κB等信号通路发挥神经保护作用[25]。AMI时，海马组织缺血缺氧，导致大量Glu在神经细胞间隙聚集，过度激活相应受体，产生神经毒性[26,27]。有实验表明，m Glu R2/3激活可通过抑制Glu释放和降低其细胞外浓度减轻缺氧缺血大鼠海马CA1区神经元损伤[28]。本实验采用左冠状动脉前降支结扎法建立AMI大鼠模型，HE染色示心肌细胞疏松、肿胀，炎性细胞浸润严重，心肌组织Caspase-3活性升高，海马组织Glu含量增加，m Glu R2/3阳性表达升高，凋亡细胞数增加；电针“神门”“通里”能降低AMI大鼠心肌组织Caspase-3活性，海马组织Glu含量、m Glu R2/3阳性表达及凋亡细胞数，提示电针能减轻海马Glu堆积，改善AMI大鼠海马细胞凋亡。

研究发现，经侧脑室向室旁核内注入Glu和Glu受体激动剂N-甲基-D-天冬氨酸可导致交感神经兴奋性增加[23]；抑制下丘脑室旁核谷氨酸能神经元兴奋可减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤[6,24]。本实验发现，AMI造模后经侧脑室注射m Glu R2/3选择性抑制剂LY341495，海马组织m Glu R2/3阳性表达降低，PI3K、Akt蛋白表达升高，Caspase-3蛋白表达降低，大鼠心肌细胞水肿减轻，炎性细胞浸润减少，心肌组织Caspase-3活性降低。电针与抑制剂作用相似，表明电针可能通过抑制海马m Glu R2/3表达降低Glu神经毒性，激活PI3K/Akt信号通路，进而发挥改善AMI大鼠心功能和海马损伤作用。

综上所述，电针“神门”“通里”可改善AMI大鼠心肌损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路，抑制m Glu R2/3过度表达、减少Glu蓄积、抑制海马组织凋亡，从而减轻神经毒性有关。

参考文献:

[3]刘俊,梁尚栋.心肌缺血与交感神经传入的研究进展[J].中国药理学通报,2011,27(12):1629-1632.

[4]李春艳,赵洪庆,杨蕙,等.谷氨酸兴奋毒性及其调节剂的研究进展[J].中国药理学通报,2022,38(5):645-649.

[6]陈振星,何淑芳,许士进,等.特定药物激活受体介导PVN谷氨酸能神经元抑制对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响[J].中国药理学通报,2022,38(1):47-53.

[7]王堃.针刺心经对心肌缺血模型大鼠海马CA1区神经递质含量的影响[D].合肥:安徽中医药大学,2018.

[8]蒋志明,张辽,刘磊,等.电针心经激活核因子E2相关因子2/血红素氧合酶信号通路抑制铁死亡改善急性心肌缺血[J].针刺研究,2023,48(5):461-468.

[9]吴立斌,张帆,余情,等.电针心经腧穴对急性心肌缺血大鼠心肌Akt/mTOR通路的影响[J].针刺研究,2022,47(2):121-128.

[10]蔡向红,梁昕,申霖来.心与脑表里配合关系之探讨[J].中国中医基础医学杂志,2013,19(2):131-133.

[11]周欢,张军平.“血-脉-心-神”共调理念在冠心病治疗中的阐释[J].中国中医基础医学杂志,2017,23(5):651-653,661.

[12]赵恬田,国海东,宣守松,等.电针对急性心肌梗死小鼠心肌组织炎症反应､趋化因子及心肌细胞凋亡水平的影响[J].中国中医药信息杂志,2021,28(1):44-48.

[13]吴欣,吴生兵,左海燕,等.基于代谢组学探讨前额叶皮质参与针刺抗心肌缺血的相关分子机制[J].针刺研究,2022,47(11):962-968.

[22]付蕊,徐桂芝,朱海军.经颅磁刺激对学习记忆及大脑神经突触可塑性影响的研究进展[J].生物医学工程学杂志,2021,38(4):783-789.

[23]王昊,戴双双,许民辉.代谢型谷氨酸受体调节剂在颅脑损伤后应用研究进展[J].检验医学与临床,2014,11(19):2758-2760,2763.

基金资助:国家自然科学基金(82004462);安徽省中医药领军人才建设项目(2019年);浙江中医药大学科研开放基金(ZYXYB2019002);

文章来源:童思佳,王堃,吴生兵等.电针对急性心肌缺血大鼠海马谷氨酸系统的影响[J].中国中医药信息杂志,2024,31(03):92-97.