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双氢青蒿素对人急性T淋巴细胞白血病细胞增殖及凋亡的影响分析

2020-06-19 239 上传者：管理员

摘要：目的:观察双氢青蒿素(DHA)对人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)Jurkat细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用CCK-8法检测DHA对Jurkat细胞的增殖抑制作用及N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对DHA抑制的细胞活力的的恢复;流式细胞术测定细胞凋亡、活性氧(ROS)产生;Westernblot法检测DNA损伤和凋亡相关基因的蛋白表达。结果:DHA对Jurkat细胞增殖有明显抑制作用,具有剂量依赖性(r=-0.936),NAC能部分恢复DHA对细胞增殖抑制的活力。流式细胞术检测显示,随着药物浓度的增高,细胞凋亡率增高(r=0.946),ROS累积量也增高(r=0.965);Westernblot结果显示,DHA处理Jurkat细胞后,DNA损伤相关基因γ-H2AX和凋亡相关基因p53、c-Caspase3、BAX、cPARP的蛋白表达明显增加,BCL-2蛋白表达降低。结论:DHA诱导Jurkat细胞产生ROS,引起DNA损伤,激活P53凋亡通路,促使细胞凋亡。

关键词：
凋亡
双氢青蒿素
急性T淋巴细胞白血病
活性氧
白血病
血液科疾病
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双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）是青蒿素（artemisinin）的衍生物，从黄花蒿（artemisiaannuaL）叶中提取分离的一种具有过氧桥的新型倍半萜内酯类化合物，为新型抗抗疟药物[1]。有研究发现,DHA还有抗菌、增加放疗敏感性、逆转耐药及抗肿瘤的作用[2,3]。DHA通过诱导细胞凋亡选择性地抑制肿瘤细胞生长[3,4]。但DHA诱导急性T淋巴细胞白血病（T-cellacutelymphoblasticleukemia,T-ALL）细胞凋亡的路径和潜在的分子机制仍然不清楚。本研究以人T-ALLJurkat细胞为靶细胞，观察DHA对细胞增殖和凋亡的影响，并对其机制进行初步探讨。

材料和方法

试剂与仪器

DHA（北京科泰新技术公司）溶解100%二甲基亚砜（DMSO，美国Amresco公司），-20℃保存。N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-cysteine,NAC）购自武汉远城科技发展有限公司，CCK8试剂盒购自上海碧云天生物科技研究所，凋亡检测试剂盒购自南京凯基公司，二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自天津滨韵科技公司。细胞培养箱（Thermo，美国）,流式细胞仪（ACEANovoCyte，美国）,酶标仪（Awareness，美国），双色红外激光扫描成像系统（Licor，美国）,RPMI1640培养液（Hyclone，美国）。

细胞的培养

Jurkat细胞株购自中国科学院细胞库（中国上海），用含有10%胎牛血清（Gibco，美国），1%青霉素（100U/mL）和链霉素（100μg/mL）的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2和95%湿度的培养箱中培养传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

DHA对细胞增殖抑制的CCK-8检测

取对数生长期Jurkat细胞，细胞计数调整至4×10[5]/ml，用RPMI1640培养液重悬，接种到96孔板，每孔100μl。加入不同浓度（10,20,40,60,80μmol/L)DHA，在37℃、5%CO2培养箱中培育12h，在每孔加入10μlCCK-8试剂，用酶标仪测定波长为450nm的吸光度（A）值，计算细胞的增殖抑制率。相同条件下将细胞接种到96孔板，在NAC(5mmol/L）预处理和对照细胞中加入DHA(20μmol/L）作用12h，用CCK-8法检测细胞的增殖抑制率。

细胞凋亡的流式细胞术检测

将细胞以2×10[6]个细胞的密度接种于6孔板中，分别加入不同浓度（10,20μmol/L)DHA，温育12h后，收取细胞并用PBS洗涤2次。500μl结合缓冲液重悬细胞，分别加入10μlAnnexinV-FITC和5μlPI混匀，室温避光反应10min。上流式细胞仪（ACEANovoCyte，美国）检测细胞凋亡百分比。

活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）水平的DCFH-DA检测

将Jurkat细胞以同上处理后收取细胞用PBS洗涤2次后，500μl结合缓冲液重悬细胞后加入5μmol/LDCFH-DA后室温避光反应30min，采用流式细胞术测定DCF的荧光强度。

DNA损伤和凋亡相关蛋白表达的Westernblot检测

Jurkat细胞以同上方法处理后，收取细胞用PBS洗涤2次后，加入蛋白液裂液裂解提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法蛋白定量、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜、TBST缓冲液洗膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入一抗，1∶4000稀释兔抗人Caspase3、BAX、cPARP、BCL2、β-actin单克隆抗体、1∶2000稀释兔抗人p53、γ-H2AX单克隆抗体中4℃孵育过夜，β-actin作为内参照，加入IRDyeTM800CW染料标记的山羊抗兔二抗、或山羊抗鼠二抗，室温孵育1h,TBST洗涤3次，用双红外激光扫描成像系统进行荧光显色及分析。

一、统计学分析

所有实验均进行3次，采用SPSS21.0软件，计量资料以表示，实验数据采用t检验和方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

DHA对Jurkat细胞生长的影响

CCK-8法检测细胞抑制率结果显示，随着药物浓度的升高，DHA对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，具有剂量依赖性（r=-0.936）（图1）。

DHA对Jurkat细胞凋亡的影响

Jurkat细胞分别加入不同浓度（10、20μmol/L）的DHA作用12h，使用PI染色后上流式细胞仪上检测。结果显示，DHA未作用时，细胞凋亡率为（4,50±0.53)%,DHA10μmol/L作用时，细胞凋亡率为（14.14±0.15)%,DHA20μmol/L作用时，细胞凋亡率为（57.30±0.35）%。随着DHA浓度升高，Jurkat细胞凋亡比例也逐渐升高，凋亡细胞百分比呈剂量依赖（r=0.946）（图2），差异有统计学意义（P<0.05）。

DHA对Jurkat细胞ROS生成的影响

Jurkat细胞分别加入不同浓度（10、20μmol/L）的DHA作用12h，加入DCFH-DA后流式细胞术检测细胞ROS的产生量。结果显示，DHA10μmol/L作用时，Jurkat细胞ROS生成相对量为（2.75±0.27）%，而DHA20μmol/L作用时，ROS生成相对量为（3.65±0.32）%，随着DHA浓度升高，Jurkat细胞ROS水平逐渐升高（r=0.965）（图3），各组间差异有统计学意义（P<0.05）。

NAC对DHA抑制细胞活力恢复的作用

在经或不经ROS清除剂NAC(5mmol/L）预处理的Jurkat细胞中加入DHA(20μmol/L），处理12h后CCK-8法测量细胞活力。结果显示，在未经NAC处理的Jurkat细胞中，DHA处理后的细胞活力为（50.44±8.35）%，而NAC处理的细胞在DHA处理后的细胞活力为（80.86±3.23）%（图4）。这表明，NAC能部分恢复DHA抑制的细胞的活力，差异有统计学意义（P<0.05）。

DHA对Jurkat细胞DNA损伤和凋亡相关蛋白表达的影响

用DHA10、20μmol/L处理Jurkat细胞12h后，Westernblot检测DNA损伤和凋亡相关蛋白的表达。结果显示，Jurkat细胞在DHA作用后，DNA双链断裂的标志γ-H2AX[5]和抑癌基因P53的蛋白表达明显升高，P53下游促凋亡基因Caspase3活化片段c-Caspase3、BAX蛋白水平表达增加，BCL-2蛋白表达下降，BCL-2/BAX比值逐渐降低，caspase的切割底物cPARP蛋白表达增加（图5，附表）。这表明，DHA诱导Jurkat细胞DNA损伤，激活P53凋亡通路，促进细胞的凋亡。

三、讨论

T-ALL是一种起源于淋巴细胞的前体T细胞以恶性增殖为主的血液恶性系统肿瘤，是最常见的白血病类型，分别在儿童和成人ALL病例占15%和25%[6]。目前，T-ALL疗法有很大的进步，但因化疗药物大多具有较强的毒副作用及可能出现耐药现象，儿童的总体存活率仍约为60%-70%，成人仅为30%-40%[7,8]，迫切需要探索新的针对其的抗癌药物。DHA是FDA批准的抗疟疾药物，安全，耐受性好，治疗效果高效，临床应用广泛。有研究显示，DHA对不同的人源癌细胞有强烈的杀伤作用[9,10]。但是，很少有研究探讨DHA对于T-ALL的作用，且DHA抗肿瘤的具体机制仍未能明确阐明。

目前，有研究认为，DHA因其独特的过氧桥结构,可以被铁裂解产生大量自由基，如ROS，引起肿瘤细胞氧化应激、延迟细胞周期,诱导细胞凋亡。产生的ROS除了氧化损伤蛋白质分子,还可以烷化DNA，直接造成肿瘤细胞的DNA损伤，引起DNA双链断裂（doublestrandedbreaks,DSB)[11]。DSB发生后，细胞启动DNA损伤应答，主要通过激活DNA依赖性蛋白激酶和ATM(Ataxiatelangiectasia-mutated）等[12]。ATM激活后启动DNA修复，如果修复失败，没能切除的DSB使ATM直接或间接地活化p53，增强p53下游促凋亡基因转录，诱导细胞凋亡[13,14]。

本研究结果显示，DHA作用Jurkat细胞后，细胞活力明显受到抑制，并且呈剂量依赖性，同时细胞内ROS出现累积，并诱导细胞凋亡。而ROS清除剂NAC能部分恢复DHA诱导的细胞死亡，这说明，DHA通过诱导Jurkat细胞产生ROS，促进细胞凋亡。同时，随着DNA双链断裂的标志γ-H2AX蛋白量的增加，P53蛋白表达增加，P53活化，促进粒体凋亡途径的促凋亡基因BAX转录，表达出的产物BAX蛋白可与抗凋亡基因BCL-2的蛋白结合，BCL-2蛋白表达下降，BCL-2/BAX比值下降，启动了细胞的凋亡程序[15,16]。P53活化激活线粒体凋亡通路，级联反应激活Caspase3,Caspase3活化片段蛋白量c-Caspase3和Caspase的切割底物cPARP蛋白表达增加，进一步激活下游Caspase家族成员，引起Jurkat细胞凋亡[17]。

本研究结果显示，DHA可以通过诱导Jurkat细胞产生ROS，引起DNA损伤，激活P53凋亡通路，诱导细胞凋亡，从而抑制细胞增殖，这为DHA对T-ALL的治疗提供了体外的实验依据，为T-ALL的治疗提供了新的选择。

孙维栋,余醒醒,安依涵,王鑫,王莹,童向民.双氢青蒿素通过激活氧化应激诱导人急性T淋巴细胞白血病细胞凋亡[J].中国实验血液学杂志,2020,28(03):753-757.