脂肪间充质干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种多能干细胞，具有体内储存量大、获取容易、稳定增殖等特点[1]。脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能和强大的旁分泌作用，在体外可分化为成脂细胞、成骨细胞、软骨细胞等，并能大量分泌细胞因子[2,3,4,5,6]，在血管生成、免疫调节、造血支持、皮肤创面愈合等方面发挥重要作用[7]。目前脂肪间充质干细胞已经运用到大量的临床试验中，尤其是缺血性疾病的治疗[8]，且取得了一定的成果。

氧体积分数发生变化将引起细胞生理功能出现相应的改变。正常机体的平均氧体积分数为5%，但目前大部分干细胞研究都是在常氧(体积分数21%O2)条件下进行的[9]。研究表明，生理状态下脂肪间充质干细胞是在低氧环境下生存的，因此在体外低氧环境下培养脂肪间充质干细胞更符合体内环境[10]。目前国内外对犬脂肪间充质干细胞的研究很少，未见低氧培养对犬脂肪间充质干细胞影响的研究。该实验拟比较体积分数21%O2和体积分数5%O2培养条件对犬脂肪间充质干细胞形态、增殖、分化及细胞因子分泌等方面的影响，为干细胞应用于宠物疾病治疗提供基础研究依据以及人类疾病治疗提供临床前研究依据。

1、材料和方法

1.1 设计

细胞学体外实验。

1.2 时间及地点

实验于2019年6至12月在佛山科学技术学院生命科学与工程学院动物生理实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

1只1岁龄雄性中华田园犬，体质量约8kg，由佛山科学技术学院兽医院提供。

1.3.2 实验试剂

Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(以色列BioInd公司)；青霉素-链霉素双抗溶液(美国Hyclone公司)；间充质干细胞成骨、成脂诱导液(美国Cyagen公司)；DMEM/F12基础培养基(美国Hyclone公司)；CD90抗体(美国ThermoFisher公司)；CD44和CD105抗体(美国BD公司)；CD45和CD73抗体(美国GeneTex);MiniBESTGeneralRNA、PrimeScriptRT试剂盒(日本Takara公司)。

1.3.3 实验仪器

流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；PCR仪(瑞士RocheDiagnostics公司)；CO2恒温培养箱(美国HealForce公司)；三气培养箱(美国HealForce公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 犬脂肪间充质干细胞分离与培养

麻醉后无菌从犬腹部取约1cm3的脂肪组织，用含5%双抗的PBS清洗干净，用组织剪将脂肪组织剪碎至1mm3，转移至15mL离心管中，加入5倍体积的0.1%(1g/L)Ⅰ型胶原酶，于37℃培养箱中消化1h，用100目细胞筛过滤组织消化液，1000r/min离心5min，弃上清，用PBS重悬细胞沉淀后再次1000r/min离心5min，弃上清，加入含体积分数10%无菌胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%L-谷氨酰胺的DMEM培养基，混匀制成细胞悬液，接种至60mm2细胞培养皿中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养48h后换液，PBS洗去不贴壁细胞，以后每3d换1次液，倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，此时细胞为原代。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定

待原代细胞融合至80%-90%时进行细胞消化、传代，此时培养的细胞为第1代。对其进行流式细胞术鉴定细胞表面标记CD44、CD90、CD45、CD105。

1.4.3 细胞分组处理

取传至第2代的脂肪间充质干细胞，消化计数，离心后弃上清，加入干细胞培养基重悬细胞沉淀。将细胞随机分为常氧组和低氧组，两组细胞数量一致，分别置于氧体积分数分别为21%,5%的恒温培养箱中培养。

1.4.4 细胞生长曲线制作及计算倍增时间

取常氧组和低氧组生长良好的第3,6,9代脂肪间充质干细胞，用胰酶消化后制成细胞悬液，以2×107L-1的细胞浓度接种0.5mL于24孔培养板中，分别置于37℃常规恒温培养箱(体积分数21%O2、5%CO2、74%N2)和三气培养箱(体积分数5%O2、5%CO2、90%N2)中培养，每天同一时间点随机选取3孔细胞消化后计数，结果取3个孔的平均值，连续计数8d，未消化的孔每隔3d换1次液。根据统计结果，以天数为横坐标，细胞数为纵坐标绘制生长曲线。根据公式PDT=t×[lg2/(lgNt-lgNo)](t为培养时间，No为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数)，计算细胞群体倍增时间。

1.4.5 流式细胞仪鉴定第6代脂肪间充质干细胞表面标记

取常氧组和低氧组生长良好的第6代脂肪间充质干细胞，待细胞长至70%-80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，按细胞浓度为3×108L-1接种于流式管中，PBS洗涤2次，加入荧光标记单克隆抗体CD44、CD90、CD45、CD105，轻轻混匀，室温避光孵育30min,1h内上机检测。

1.4.6 成脂诱导

取常氧组和低氧组生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，按细胞浓度为1×107L-1接种到24孔板内，待细胞100%融合后，弃去孔内培养液，每孔加入0.5mL间充质干细胞成脂诱导分化A液，连续培养72h，然后换为间充质干细胞诱导分化B液，诱导培养24h，再换回A液，重复A液和B液至少3个循环。当孔内出现较多脂滴时，将细胞在B液中培养3d，进行油红O染色。

1.4.7 成骨诱导

取常氧组和低氧组生长良好的第3代脂肪间充质干细胞，按细胞浓度为1×107L-1接种到24孔板内，待细胞100%融合后，弃去孔内培养液，每孔加入0.5mL间充质干细胞成骨分化诱导液进行诱导培养，每隔72h换液1次。经过2周的时间，当可见较多骨钙化结节形成时进行茜素红染色。

1.4.8 采用实时荧光定量PCR法检测细胞因子mRNA表达

取第6代对数生长期的常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞，弃去培养液，预冷PBS洗涤细胞，使用MiniBESTGeneralRNA提取试剂盒提取细胞总RNA，检测总RNA浓度和纯度合格后，使用PrimeScriptRT试剂盒和SYBRgreen-RT-PCR将总RNA反转录为cDNA。血管内皮生长因子、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、肝细胞生长因子及内参基因β-actin引物序列见表1。qRT-PCR反应体系：TBGreenPremixExTaqII12.5μL，上下游引物各1μL,cDNA(<100ng)2μL,ddH2O8.5μL。qRT-PCR反应条件：预变性(95℃，30s)、PCR(95℃，5s;60℃，30s;40个循环)、熔解[95℃，5s;60℃，1min;95℃(AcquisitionMode:Continuous);1个循环]、降温(50℃，30s)。采用2-∆∆Ct法计算目的基因相对表达量。

1.5 主要观察指标

低氧培养环境下脂肪间充质干细胞的形态特征、增殖速度、表面标志物、分化能力和细胞因子分泌水平的变化。

1.6 统计学分析

实验数据采用SPSS19.0软件进行分析，两独立样本比较采用独立样本t检验，不同组间比较采用单因素方差分析，数据用表示，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 常氧组和低氧组的细胞形态

在倒置显微镜下观察，常氧组和低氧组第3,6,9代细胞培养48h后，两组细胞形态没有明显差异，细胞形态均一，呈梭形或长梭形，汇合的细胞呈漩涡状或网状排列，见图1。

2.2 流式细胞仪检测第1代犬脂肪间充质干细胞表面标记

第1代犬脂肪间充质干细胞阳性表达特定抗体CD105、CD44、CD90，阴性表达CD45，表达率分别为92.88%,99.03%,99.18%,0.10%，见图2。根据国际脂肪应用技术协会规定的脂肪间充质干细胞表型鉴别标准，实验所分离的细胞是脂肪间充质干细胞。

2.3 低氧培养可促进犬脂肪间充质干细胞增殖

由绘制的生长曲线可知，常氧组和低氧组的细胞曲线均呈“S”型，经历潜伏期、对数生长期和平台期。两组细胞在第1,2天增殖不明显，3-7d进入对数生长期，7d后开始增长缓慢，见图3。根据细胞计数结果，计算常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞的群体平均倍增时间。由表2可知，低氧组脂肪间充质干细胞具有比常氧组更短的细胞倍增时间，说明低氧组细胞具有较快的生长速度，其细胞增殖能力比常氧组强。

2.4 常氧组和低氧组第6代脂肪间充质干细胞表面标记的表达

第6代常氧组和低氧组细胞均高表达CD90、CD44、CD105，不表达CD45，见图4,5和表3，证实两组细胞在多次传代培养后仍具备间充质干细胞的表型特征。

2.5 低氧环境促进犬脂肪间充质干细胞成脂、成骨分化

成脂诱导分化后，常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞由纤维状逐渐缩短、变圆。由图6A、B可知，低氧组于第8天出现散在的点状小脂滴，而常氧组在第10天开始出现脂滴，继续培养至第16天，脂滴增多增大，油红O染色可见低氧组的染色脂滴比常氧组多，见图6C、D。

成骨诱导3d后常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞由纤维状开始变为多边形、鳞片状。由图6E、F可知，低氧组细胞在诱导6d后出现骨钙化结节，而常氧组在8d开始出现明显的骨钙化结节，两组细胞均在诱导12d进行茜素红染色。结果显示，低氧组比常氧组更早出现钙结节，而且染色后低氧组的红色矿化沉着物比常氧组多，见图6G、H。

2.6 低氧环境对犬脂肪间充质干细胞中相关细胞因子mRNA表达的影响

低氧组犬脂肪间充质干细胞中脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子的mRNA相对表达量均显著高于常氧组(P<0.05)，而睫状神经营养因子和肝细胞生长因子的mRNA相对表达量也高于常氧组，但差异无显著性意义(P﹥0.05)，见图7和表4。

图1|常氧组(A-C)和低氧组(D-F)不同代数犬脂肪间充质干细胞形态(标尺为100μm)

图2|第1代犬脂肪间充质干细胞流式细胞术鉴定结果

图3|常氧和低氧组第3,6,9代脂肪间充质干细胞生长曲线

图4|常氧组第6代脂肪间充质干细胞流式细胞术鉴定结果

图5|低氧组第6代脂肪间充质干细胞流式细胞术鉴定结果

图6|两组脂肪间充质干细胞成脂、成骨诱导分化结果(×100)

图7|低氧环境对犬脂肪间充质干细胞相关细胞因子mRNA表达的影响

3、讨论

相比于骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞，脂肪干细胞数量丰富、易于获取、具有良好安全性且不存在伦理争议[11,12]。生理条件下各组织细胞生存环境的氧体积分数不同，动物血液中氧体积分数为10%-13%，软骨细胞(无血管组织)氧体积分数为0%-7%，脑组织氧体积分数为3%-14%，肺泡血管氧体积分数为14%，骨髓腔内氧体积分数为1%-7%[13]。研究表明，低氧预处理能显著提高脂肪干细胞的增殖、分化和分泌细胞因子能力[5,14]，但低氧环境对犬脂肪干细胞的影响尚不清楚。

表1|各基因引物序列及扩增长度

表3|常氧组和低氧组第6代脂肪间充质干细胞表面标记表达率(%)

实验成功从犬腹部脂肪组织中分离并鉴定了犬脂肪间充质干细胞，在第2代时将细胞分为常氧组(氧气体积分数为21%)和低氧组(氧气体积分数为5%)，比较了两组细胞的形态特征、增殖速度、细胞表面标志物、分化能力和细胞因子分泌水平等。在传代过程中两组细胞形态稳定，均表现为长梭形，大量增殖后细胞群呈漩涡状或网状排列，符合脂肪间充质干细胞的形态特征，两组细胞形态无明显差异。刘林奇等[15]研究显示低氧刺激可提高脂肪间充质干细胞的增殖速度。作者的实验结果显示，低氧组比常氧组更快进入对数生长期，且群体倍增时间比常氧组短，提示低氧培养可提高脂肪间充质干细胞的增殖能力。适度低氧环境下脂肪间充质干细胞中的缺氧诱导因子1α表达明显增加[16,17]，刺激ERK1/2及Akt磷酸化，该磷酸化已被证明能够介导脂肪间充质干细胞的增殖[18,19]，提示低氧环境下脂肪间充质干细胞的增殖可能是通过缺氧诱导因子1α进行调节的。脂肪间充质干细胞表达干细胞特异性组合表面标记物CD90、CD105、CD73、CD44和CD166，不表达细胞标记物CD45和CD34[20]。该实验通过流式细胞术检测第6代常氧组和低氧组脂肪间充质干细胞表面标记物，结果显示两组细胞均高表达CD44、CD90和CD105标记物，而不表达CD45，提示低氧培养对脂肪间充质干细胞的表面标记物无明显影响。

研究发现低氧条件下血管内皮生长因子等成血管因子基因表达量增高[21]。另外，抗炎因子白细胞介素1、白细胞介素6和白细胞介素10基因表达在低氧条件下也上调[21,22]，进而促进组织血管再生、抑制炎症反应[23]。该实验通过实时荧光定量PCR法检测常氧组和低氧组的脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和睫状神经营养因子4种细胞因子的mRNA相对表达量，结果显示：低氧组脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子的mRNA相对表达量显著高于常氧组，但两组细胞的肝细胞生长因子和睫状神经营养因子的mRNA相对表达量无明显差异，提示低氧环境对脂肪间充质干细胞的分泌功能有一定促进作用。

表2|常氧和低氧组第3,6,9代脂肪间充质干细胞倍增时间

表4|两组犬脂肪间充质干细胞相关细胞因子mRNA相对表达量

脂肪间充质干细胞具有多项分化潜能[24,25,26]。VALORANI等[27]研究发现低氧预处理能够促进脂肪间充质干细胞成脂分化。XU等[28,29]将脂肪间充质干细胞置于成骨分化诱导培养基中进行低氧培养，结果促进脂肪间充质干细胞成骨分化，即骨相关基因、碱性磷酸酶、矿化活性因子及成骨生长因子释放增加。该实验采用成脂、成骨分化培养基对常氧组、低氧组脂肪间充质干细胞进行诱导分化，结果发现低氧组细胞的成脂、成骨分化出现时间较早，成脂诱导第8天出现脂滴，成骨诱导第6天出现骨钙化结节。KIM等[30]指出线粒体活性氧的产生能够促进脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化，并且在应用线粒体活性氧清除剂后，低氧诱导的成脂分化受到显著抑制。XU等[28]将骨形态发生蛋白腺病毒载体转染的脂肪间充质干细胞进行低氧处理，结果提示低氧环境下可过表达骨形态发生蛋白2基因，从而加速诱导脂肪间充质干细胞向成骨方向分化。

综上所述，氧体积分数为5%的低氧环境可促进脂肪间充质干细胞的增殖、多向分化及细胞因子分泌。适当的低氧环境对脂肪间充质干细胞生理学特性的研究具有重要的意义。然而目前对于低氧影响脂肪间充质干细胞的具体作用机制还未能完全清楚，还需做进一步的深究。

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基金:广东省自然科学基金(2017A030313171),项目负责人:王丙云;广东省自然科学基金(2018A030313892),项目负责人:陈胜锋.