首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 血液科论文 > 泰国型α缺失地中海贫血的快速基因诊断方法的建立

泰国型α缺失地中海贫血的快速基因诊断方法的建立

2021-04-02 421 上传者：管理员

摘要：目的:建立一种快速、简便且无需核酸提取的泰国型α缺失地中海贫血的快速基因诊断方法及其在产前诊断中应用。方法:设计可以扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因的特征序列引物组，直接以待测样本为模板，不需要核酸提取，进行聚合酶链反应(PCR)直接扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳即可分析结果。结果:成功建立泰国缺失型地中海贫血的快速基因诊断方法，并且直接以全血、羊水、干血斑、脐带血为模板进行扩增的结果与常规跨越断裂点聚合酶链反应(gap-PCR)技术确定基因型完全一致。结论:该法不需要提取核酸，减少操作步骤与实验室污染、节约成本、快速、准确，可作为常规方法用于临床样品的地中海贫血分子基因检测及巴氏水肿胎和缺失型HbH病的产前诊断及泰国型α-地中海贫血的产前诊断新方法。

关键词：
产前诊断
地中海贫血
基因诊断
直接PCR
加入收藏

α-地中海贫血(α-thalassemia,简称α-地贫)属于常染色体隐性遗传病，是α-珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷而导致α-珠蛋白链合成减少或缺失为特征的遗传性溶血性贫血[1]。缺失型α-地贫是α-地贫的主要原因，缺失型α-地贫是由于两个功能性α基因全部缺失，则α珠蛋白链的合成功能受抑制，例如东南亚人群中最常见的--SEA(东南亚型)以及--THAI(泰国型)[2,3]。泰国型α-地贫是东南亚地区最常见的遗传性疾病之一，由于不同种族人群的基因突变发生率不同，临床严重程度也不同[4]。泰国型缺失基因型在临床上可以形成中重型α地贫，即泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征，受影响的胎儿容易死产或在出生后不久死亡[1,4]。孕妇在妊娠期间的并发症，包括子痫前期(高血压、伴有或不伴有蛋白尿的液体潴留)、羊水过少(分别增加或减少羊水的积累)、出血、贫血和败血症[5]。考虑到这种综合征的严重程度和孕妇在怀孕期间的并发症，在一些高危人群中已经开始进行普遍婚检及产前筛查，以便能及时发现、处理泰国型缺失纯合子的地贫[6]。由于泰国型的血液学特征与东南亚缺失型α地贫一致，均表现出小细胞低色素，平均细胞体积和平均血红蛋白含量降低等，因而可能造成误诊和漏诊[7]。

目前产前基因诊断的方法大多先采集孕妇外周血和胎儿的细胞样本(羊水、脐带血等),提取DNA或经过细胞培养后提取DNA,再进行PCR扩增及对扩增产物进行分析[8]。如果不需要细胞培养和DNA提取，直接用取样标本扩增，可大大缩短检测所需时间和成本，也可避免在细胞培养和DNA提取过程中导致的样本间交叉污染和微量样本丢失。笔者研发一种能够直接对全血、羊水、脐带血、滤纸片干血斑(driedbloodspots,DBS)等标本进行PCR直接扩增的检测泰国型α-地贫方法，有望成为临床上产前诊断泰国型α-地贫的新方法。

1、材料与方法

1.1标本来源

本研究中使用的所有抗凝外周血、脐带血、羊水、DBS等生物样本均来自于我院的地贫患者和正常健康者，患者均知情同意，所有样本均经常规跨越断裂点聚合酶链反应(gap-PCR)技术确定基因型。同时收集220例外周血样本(已知基因型)进行单盲检测。

1.2引物的设计

如表1所示，可以扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因的特征序列引物组上下游分别是THAIF和THAIR,正常基因的特征序列引物组上下游分别是APF和APR,引物工作浓度10μmol/L。

1.3快速检测--THAI缺失型地贫的直接PCR法

采集抗凝外周血、-20℃～-80℃保存未反复冻融的陈旧性抗凝外周血、培养羊水细胞、脐带血、DBS样本等标本直接作为模板，也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。配制PCR反应配方及体系，将引物THAIF、THAIR、APF和APR、PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP和水配制成反应体系。以待测样本直接为模板加入配制的反应体系中混合进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃预变性5min,然后94℃30s,64℃退火35s,34个循环，得到扩增产物(PCR反应液配方体系及反应条件见表2)。取PCR扩增中的产物4.0～5.0μL,点样于2.0%～2.5%琼脂糖凝胶外加0.005%核酸染料，在5V/cm电压下电泳30～35min,取出于凝胶成像系统里观察结果并拍照保存。

1.4数据分析及结果判定

根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析判读结果，只得到1条317bp条带时，结果为正常野生型；得到478bp和317bp2条带时结果初步判断为携带--THAI等位基因；仅得到1条478bp条带时，结果初步判断为--THAI等位基因纯合子或者--THAI等位基因纯合子待排除。结果初步判断为正常型。

表1检测--THAI地贫特征序列的引物组

表2PCR反应液配方体系及反应条件

2、结果

2.1全血标本扩增试验

为了证实直接PCR法检测--THAI缺失型地贫对全血样本的扩增效果，选取携带--THAI地贫与正常基因型的全血进行直接PCR试验，并设置阴性对照，结果见图1。根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，泳道1只得到1条317bp条带，结果为正常野生型，泳道2得到478bp和317bp2条带，结果为携带--THAI等位基因。所有样本均能有效地扩增，条带单一且清晰，结果与常规Gap-PCR技术确定的基因型完全一致，片段大小正确，验证直接PCR法用于全血直接扩增的可行性。

图1全血标本琼脂糖凝胶电泳结果

2.2DBS标本扩增试验

全血滴在滤纸片上制成DBS,有很好的生物稳定性和安全性，应用DBS对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利[9]。为了证实直接PCR法检测--THAI缺失型地贫对DBS样本的扩增效果，选取携带--THAI地贫与正常基因型的DBS进行直接PCR试验，并设置阴性对照，结果见图2。根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，泳道1得到478bp和317bp2条带，结果为携带--THAI等位基因，泳道2只得到1条317bp条带，结果为正常野生型，所有样本均能有效地扩增，条带单一且清晰，结果与常规Gap-PCR技术确定的基因型完全一致，片段大小正确，验证直接PCR法用于DBS直接扩增的可行性。

图2DBS标本琼脂糖凝胶电泳结果

2.3羊水标本扩增试验

为了证实直接PCR法检测--THAI缺失型地贫对羊水样本的扩增效果，选取携带--THAI地贫与正常基因型的羊水进行直接PCR试验，并设置阴性对照，结果见图3。根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，泳道1得到478bp和317bp2条带，结果为携带--THAI等位基因，泳道2只得到1条317bp条带，结果为正常野生型，所有样本均能有效地扩增，条带单一且清晰，结果与常规Gap-PCR技术确定的基因型完全一致，片段大小正确，验证直接PCR法用于羊水直接扩增的可行性。

图3羊水标本琼脂糖凝胶电泳结果

2.4脐带血标本扩增试验

为了证实直接PCR法检测--THAI缺失型地贫对脐带血样本的扩增效果，选取携带--THAI地贫脐带血提取的DNA与正常基因型的脐带血进行直接PCR试验，并设置阴性对照，结果见图4。根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析，泳道2只得到1条317bp条带，结果为正常野生型，泳道3得到478bp和317bp2条带，结果为携带--THAI等位基因，所有样本均能有效地扩增，条带单一且清晰，结果与常规Gap-PCR技术确定的基因型完全一致，片段大小正确，验证直接PCR法用于脐带血直接扩增的可行性。而且，脐带血PCR的扩增效率与提取DNA的PCR扩增效率基本一致，在一致的扩增效率情况下，本方法省略对脐带血中DNA提取的步骤，避免或减少标本污染及DNA降解的发生；实现短时间内高效检测脐带血样本。

图4脐带血琼脂糖凝胶电泳结果

2.5泰国缺失型直接PCR法在临床上应用

收集临床上220例外周血(已知基因型)采用进行泰国缺失型直接PCR法单盲试验，两者结果一致率100%。

3、讨论

地贫是世界上最常见的遗传性单基因疾病之一，这种珠蛋白基因疾病影响了数亿人，成为一个巨大的公共卫生负担，需要特别关注[10]。在中国南方的许多省份，地贫筛查被广泛使用，甚至被政府作为婚前体检的一部分[3,11]。因此，建立一系列合理的地贫检测方法是非常重要的。目前泰国缺失型α地贫尚无理想的治疗方法，因而产前诊断对有--THAI缺失型地贫家族史的孕妇十分重要[7]。

由于外周血中免疫球蛋白成分、抗凝剂等通常是PCR抑制剂[12,13]。研究表明Taq-DNA聚合酶和黄金Taq-DNA聚合酶是PCR中最常用的聚合酶，当外周血含量在体系中不到0.2%时，聚合酶活性可被完全抑制[13,14]。现有的实验室常规产前基因诊断泰国缺失型α地贫检测相关的技术主要基于Gap-PCR结合电泳或者杂交的方法、荧光定量PCR的方法检测，这些方法均需要从外周血等样本中提取DNA和RNA的方法多种多样。然而，这些方法一般都费时费力，而且会增加成本。此外，这些方法中涉及的多个样品处理步骤增加了交叉污染的风险，并导致靶标丢失，使得实验易出现假阴性或者假阳性，导致误检或者漏检[15,16]。此外，一些PCR抑制剂在DNA和RNA提取后仍然存在[8,17]。因此，倘若能建立一种不需要提取DNA,直接进行样本扩增，进行泰国型α-地贫的检测，一种简单、能快速准确基因分型的技术手段，对遗传咨询及产前诊断具有重要意义。

近年来，从外周血直接扩增的PCR方法一直是研究者的期盼，但是这些方法通常需要样本预处理，样品预处理包括预热、交替加热冷却和外周血的冻融，这些都是非常耗时和繁琐的[18,19,20]。本研究所述的直接PCR法可以实现单管单次闭管反应完成--THAI缺失型地贫等位基因的检测，最大程度上减少提取核酸而引起的实验室污染或标本间交叉污染或DNA降解，避免结果的假阳性和(或)假阴性；同时采用内对照，使得泰国型α-地贫基因诊断结果判读更加直观；采用直接PCR法进行待测样本直接扩增，不需要提取与纯化DNA,节省DNA提取所需的时间、人力、试剂成本等，且无需配备提取用仪器设备，大大简化了实验步骤和污染的可能。而且如图1～4所示，本研究所检测样品可选自新鲜采集的抗凝外周血、-20℃～-80℃保存且未经反复冻融的陈旧性抗凝外周血、羊水细胞、脐带血、DBS样本等，能检测的标本类型多样。另外，在--THAI缺失型地贫的诊断中，本方法降低所需的样本量，临床患者更容易接受；同时也适用DBS样本，有很好的生物稳定性和安全性，应用DBS对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利，特别是边远地区样本采集及运输、保存更方便，有利于地贫的防治工作开展[9,21,22]。另一方面，本研究采用琼脂糖凝胶电泳法，正如图1-4呈现的结果所示，条带清晰易于判定，是目前使用PCR分子诊断技术中最廉价的实验体系构建方法，成本更低，不需要昂贵的仪器和探针设计，各级实验室和医院都易开展。检测(含电泳时间)只需要约2h,在较短的检测时间内即可获得与常规DNA扩增一致的检测结果，缩短TAT时间，便于患者就诊。

综上所述，针对现有检测方法普遍存在操作繁琐、易污染和降解、耗时耗力的缺点，我们开发出一种新的检测--THAI缺失型地贫的直接PCR法，通过直接将采集到的标本作为扩增模板，不需要提取纯化DNA进行直接PCR反应，并将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳直观地读取结果。该方法可实现快速完成检测并出具检测结果报告，成功实现快速产前诊断--THAI缺失型地贫，具有快捷简洁、高度的稳定性、灵敏性和准确性，有较好的临床应用前景与成本效益，适用于大规模人群筛查及各级医院应用开展，具有较好的应用前景。因此，建立泰国型α-地贫的快速基因诊断方法，进行有效的产前基因诊断，避免泰国型缺失的HbH病和泰国型缺失的巴氏水肿胎儿的出生，对减少社会和患者家庭的负担，实现优生优育有着极其重要的意义[23]。

参考文献：

[15]沈茹,陈云明,杨晓红,等.α地中海贫血筛查及诊断技术的进展[J].分子诊断与治疗杂志,2019,11(1):68-72.

卿吉琳,陈柳燕,谭卫红,陈治中.泰国型α缺失地中海贫血的快速基因诊断方法的建立及其临床应用[J].临床血液学杂志,2021,34(04):229-232+236.