肠道菌群在维持肠道屏障通透性及完整性、调节宿主免疫反应、改善代谢途径方面起着关键作用[1,2,3]。越来越多的研究表明，极早产儿生命早期肠道菌群的结构和多样性是影响其健康非常重要的因素，肠道菌群失衡可能参与极早产儿坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis,NEC）及晚发型败血症(late-onset sepsis,LOS)的发生和发展[4,5]。通过补充益生菌早期人工定植菌群、调节肠道菌群结构，可有效预防极早产儿NEC、LOS，对其远期的生存质量也具有十分重要意义[6,7,8]。而深入了解极早产儿肠道菌群的动态变化及分布特征，有助于极早产儿益生菌早期干预提供理论依据。本研究拟前瞻性选取极早产儿为研究对象，应用16S rRNA高通量测序及生物信息分析技术探讨极早产儿生后1个月不同时间点的肠道菌群演变及分布特征。

1、对象与方法

1.1 研究对象及分组

采取前瞻性研究方法，选取2022年9月至2023年3月福建省泉州市儿童医院新生儿重症监护室收治住院的极早产儿为研究对象。纳入标准：①出生胎龄<32周；②生后24小时内入院；③经阴道分娩；④母亲无严重感染；⑤生后72 h内开奶，并接受母乳喂养；⑥家属知情同意。排除标准：①先天性消化道畸形或其他脏器严重畸形；②合并染色体异常或遗传代谢性疾病；③并发严重感染性疾病，应用广谱抗生素；④生后两周内放弃或死亡；⑤家属不同意或中途退出。

本研究的开展已经通过了医院伦理委员会的审批（2021年伦理第8号），并且所有参与研究的极早产儿均由其监护人签署知情同意书。

1.2 标本收集及处理

粪便样本采样时间为生后第7、14、21、28天，前后不超过24 h，分别标记为B1、B2、B3、B4。取样时，操作者带无菌手套，采用无菌棉签从患儿尿片中收集新鲜的粪便标本，冻存于-80℃冰箱冷冻保存直到DNA提取分析。

1.3 肠道菌群16 S rRNA高通量测序

1.3.1 实验流程

取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应的融合引物配置PCR反应体系，设置PCR反应参数进行PCR扩增，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化并溶于Elution Buffer，贴上标签，完成建库。使用Agilent2100 Bioanalyzer对文库的片段范围及浓度进行检测。检测合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序。

1.3.2 生物信息分析

下机采取按窗口去低质量的方法进行数据过滤，剩余高质量的clean data用于后期分析；通过reads之间的overlap关系将reads拼接成Tags；将Tags利用UPARSE在97%相似度下进行聚类成OTU并与数据库比对、物种注释，置信度阈值设置为0.6；基于OTU和注释结果进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析等。

1.4 临床资料收集

收集研究对象及孕母的一般资料，包括出生胎龄、出生体重、性别、孕母及患儿合并症（如孕母有无妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、肝内胆汁淤积、甲状腺功能异常等；患儿有无新生儿呼吸窘迫综合征、肺出血、动脉导管开放、支气管肺发育不良等）。

1.5 统计学方法

使用SPSS 25.0统计学软件进行数据处理分析。计数资料以例数及百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较，符合方差齐性的采用两独立样本t检验，方差不齐的采用秩和检验。不符合正态分布计量资料以中位数M(P25～P75）表示，组间比较采用非参数检验进行统计。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 一般临床资料及样本信息

研究期间符合纳入标准的极早产儿39例，排除消化道畸形1例、严重感染性疾病2例、生后2周内放弃或死亡1例，最终纳入分析的研究对象35例，男22例，女13例，出生胎龄210±11天，出生体重1 419±339 g，有创机械通气10例，平均机械通气时间2.0±4.8天，所有患儿生后早期因呼吸窘迫均使用头孢噻肟联合青霉素预防性抗感染。35例患儿共收集140份粪便标本，第7天、14天、21天、28天4个时间点的样本齐全，分别标记为B1、B2、B3、B4。

2.2 粪便样本16 S rRNA高通量测序数据

本研究140份粪便样本均成功检测，平均有138 057个原始序列，过滤后有134 274个高质量序列。所有样本的数据质量Q 20比例大于90%,Q 30比例大于85%。

2.3 门水平及属水平的肠道菌群结构

结果显示，门水平上检测到的主要优势菌群为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）。生后第7天、14天、21天、28天厚壁菌门相对丰度分别为55.6%、40.4%、24.8%、28.5%；变形菌门相对丰度分别为33.7%、53.8%、59.3%、70.8%；放线菌门相对丰度分别为2.4%、5.5%、12.5%、0.8%，见图1 A。

对极早产儿第7～28天肠道菌群在属水平的组成分布检测结果显示，检测到的主要优势菌群为埃希菌属（Escherichia）、梭菌属（Clostridium＿sensu＿stricto）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、不动杆菌属（Acinetobacter）和克雷伯杆菌属（Klebsiella）。生后第7天、14天、21天、28天埃希菌属相对丰度分别为26.9%、35.7%、37.2%、34.7%，梭菌属为1.6%、8.9%、16.1%、22.6%，葡萄球菌属为37.0%、6.0%、0.6%、0.3%；不动杆菌属为0.7%、15.7%、11.8%、0.5%；克雷伯菌属为1.1%、0.1%、1.1%、24.3%；罗氏菌属为0.03%、0.46%、11.2%、0.7%；双歧杆菌属为2.0%、4.9%、1.2%、0.02%，见图1 B。

2.4 极早产儿第7～28天肠道关键菌群差异分析

结果显示，在门及属水平的差异菌群主要为拟杆菌门（P=0.029）、蓝藻菌门（P=0.011）及葡萄球菌属（P=0.010）及罗氏菌属（P=0.040）。拟杆菌门及罗氏菌属在生后逐渐升高，在生后第21天相对丰度达高峰。而蓝藻菌门及葡萄球菌属菌群丰度从第7天起逐渐降低，生后21天及28天均未检测到蓝藻菌门，见图2A、2B。

图1 极早产儿第7～28天肠道菌群在门、属水平的组成分布   

2.5 肠道菌群的Alpla多样性及Beta多样性分析

极早产儿第7～28天肠道菌群Alpla多样性分析结果，见图3 A、3 B、3 C。四个时间点的Alpla多样性指数Ace值分别为62.35(58.75～80.63）、41.12(23.99～74.20）、38.98(31.63～50.86）、35.63(27.62～53.95),Shannon值分别为0.89(0.60～1.85）、0.26(0.07～0.72）、0.81(0.25～0.94）、0.82(0.59～0.88），组间比较差异均无统计学意义（P=0.0 5 0和P=0.101);Chao值分别为60.92(58.33～79.77）、33.50(15.00～48.00）、33.00(30.00～38.00）、26.63(24.00～30.00），四组间比较差异有统计学意义（P=0.001）。

极早产儿第7～28天肠道菌群Beta多样性分析结果，见图3 D。极早产儿第7～28天肠道菌群Beta多样性分析的Weighted-unifrac值分别为0.41(0.28～0.49）、0.50(0.21～0.53）、0.43(0.29～0.49）、0.14(0.08～0.42），差异有统计学意义（P<0.001）。

3、讨论

伴随围产医学的快速发展，人们越来越关注极早产儿的肠道菌群定制模式。较多研究表明，正常肠道菌群的建立对极早产儿的健康至关重要。极早产儿由于肠道发育未成熟，肠道正常菌群尚未建立，肠道粘膜屏障功能低下，免疫力差，出现NEC、LOS等近期并发症风险会增加，这些并发症会严重影响患儿的生活质量，甚至威胁他们的生命[9]。极早产儿早期肠道菌群的改变对儿童期，甚至成人期不同疾病的易感性也有重要影响，且其在整个生命周期中不断变化的同时伴随着典型的神经发育变化[10]。已有研究提出，生命早期有一个高度可塑性的“关键窗口期”，期间正常肠道微生物群的破坏可能对行为、神经免疫功能和神经发育产生影响[11,12]。因此，全面地了解极早产儿早期肠道菌群的特征，对于疾病的预防以及进一步探讨疾病的发病机制有着重要的现实意义。

图2 极早产儿第7～28天肠道关键菌群差异分析   

图3 极早产儿第7～28天肠道菌群Alpla多样性及Beta多样性分析   

本研究应用16S rRNA高通量测序检测极早产儿生后7～28天的肠道菌群。肠道菌群传统的研究方法依赖于细菌的分离和培养。由于肠道菌群中的大多数细菌生活的条件为兼性厌氧或严格厌氧，细菌培养的条件及时间要求严格，且环境中可培养的细菌及其少量，>99%的菌群无法被传统培养技术检测到[13]，因此对绝大多数的微生物群落功能及系统发育关系无法进行深度研究。随着分子生物技术的迅猛发展，逐步建立了以16S rRNA系统发育分析为基础的研究体系。目前，16S rRNA高通量测序已经成为当前研究微生物群落组成和分布的重要手段。

传统的细菌培养方法证实，不同于健康足月儿，早产儿生后即脱离母体转到新生儿重症监护室住进暖箱，其肠道微生物群定植受到分娩方式、喂养方式以及NICU病房环境、照护医务人员、侵入性操作、抗生素应用等多种因素的影响。然而，本研结果显示极早产儿在生后7～28天的肠道菌群分化过程仍然高度一致，在门水平上主要检测到3个菌门，包括厚壁菌门、变形菌门、放线菌门，其中厚壁菌门和变形菌门相对丰度占比接近90%左右。同时研究结果提示，厚壁菌门在生后28天有下降趋势，而变形菌门有上升趋势。Bäckhed等[14]纳入98名婴儿及其母亲，采用宏基因组检测生后第一年的肠道菌群，发现厚壁菌门和拟杆菌门是最常见的门，其次是放线菌门和变形菌门。有研究报道指出，厚壁菌门在早产儿最早的粪便样本中占主导地位[15]，但随着肠道菌群的演变进展，有一个明显的转变，即持续的变形杆菌优势[16]。Khan等[17]研究也显示早产儿早期年龄组的主要优势肠道菌群是厚壁菌门，随后的年龄组则以变形菌门为主，与正常足月儿的肠道菌群分布并不完全一致。

Cha等[18]采用不同肠道菌群测序方法比较早产儿和足月儿的肠道菌群差异，研究共纳入20例足月儿和31例早产儿，收集生后7天和28天的粪便样本69份，研究结果显示生后28天双歧杆菌属等有益菌在足月儿组显著增加，克雷伯菌属等致病菌则在早产儿组显著增加。与该研究结果相似，本研究结果显示极早产儿生后7～28天双歧杆菌属相对丰度均<5%，而生后28天克雷伯杆菌属相对丰度显著增加，达24.3%。Tirone等[19]研究提出，极早产儿的肠道微生物表现出高水平的兼性厌氧菌，如肠杆菌、链球菌和葡萄球菌，而严格厌氧菌，如双歧杆菌水平较低。以上结果表明，与足月儿相比，极早产儿双歧杆菌等益生菌定植数量少、定植时间晚，并没有迅速发展成为优势菌群，而如葡萄球菌、克雷伯菌、肠杆菌、链球菌等一些潜在致病菌则成为优势菌较长时间定植在极早产儿肠道。

不成熟的肠道菌群定植模式可能参与极早产儿NEC及LOS的发生和发展[4,5]。Beghetti等[20]通过一项初步观察性研究表明，早产儿生后早期双歧杆菌的缺乏可能是不良神经结局的生物标志物。在正常肠道菌群的建立和发展过程中，低丰度的双歧杆菌影响肠上皮屏障的完整性，导致肠道通透性增加[21,22]，来自胃肠道的菌群易位可能直接导致了黏膜屏障感染并扩散到全身，甚至诱发NEC和LOS[23,24]。Flannery等[25]为了确定极早产儿迟发性败血症的流行病学、微生物学特征，纳入了118 650例患儿，结果显示有10 501例(8.9%)发生迟发性脓毒症，99%可信区间CI为（86.4～90.7），最常见的病原菌为凝固酶阴性葡萄球菌(29.3%)和金黄色葡萄球菌(23.0%)。Bizzarro等[26]回顾性分析了耶鲁-纽黑文儿童医院NICU 20年的NEC病例，结果显示69例NEC相关性血流感染患儿主要病原体为大肠杆菌(38.6%)、克雷伯菌(17.5%)和凝固酶阴性葡萄球菌（12.3%）。本研究中，极早产儿第7～28天肠道菌群在属水平的检测结果显示，埃希菌属、克雷伯菌属、葡萄球菌属均是极早产儿生后7～28天的主要优势菌群。其中，埃希菌属丰度在生后7～28天维持持续高值，是最主要的微生物群；克雷伯菌属随着时间的推移，在生后28天成为主要的优势菌群。这表明一些机会致病菌，如大肠杆菌、克雷伯氏菌、葡萄球菌，可以在极早产儿粪便微生物群发育过程中逐渐生长。当机体免疫力低下，肠黏膜屏障功能差，这些机会致病菌很容易通过肠黏膜侵入血液，感染机体，对机体造成严重损害，如LOS、NEC等。

本研究进一步对极早产儿第7～28天的肠道菌群多样性进行比较分析，结果显示四个时间点的Alpla多样性Ace、Shannon指数均无统计学意义，Chao指数随着时间变化显著下降（P=0.001）。极早产儿第7～28天肠道菌群Beta多样性分析也显示，生后28天的Weighted-unifrac值明显下降（P<0.001）。有研究报道，与足月儿相比，早产儿肠道菌群定植较为缓慢，多样性明显降低[28]。本研究未进一步比较足月儿与极早产儿间肠道菌群多样性的差异，但从时间轴上纵向分析发现，极早产儿早期多样性伴随时间而降低；考虑与极早产儿早期免疫反应的不成熟、延迟肠内喂养和重复、长时间暴露于广谱抗生素，肠道正常菌群建立受阻有关。国外有动物实验研究报道，肠道菌群多样性的变化可以预测神经功能结局[29]。国内外多位学者研究证实，肠道菌群多样性的降低与儿童注意缺陷、多动障碍以及孤独症谱系障碍相关[30,31]。

本研究为单中心研究，受到时间、成本、标本量等的限制，不可避免存在一定的局限性。首先，本研究纳入的研究对象为经阴道顺娩、接受母乳喂养的极早产儿，未进一步分析不同分娩方式、喂养方式以及抗生素使用可能存在的不同肠道菌群定植模式；其次，研究仅选取4个时间点的样本进行跟踪检测，不可避免存在偏倚。

综上所述，极早产儿生后7～28天肠道优势菌群从厚壁菌门逐渐转变为变形菌门，并以埃希菌属、克雷伯菌属等条件致病菌为主，而双歧杆菌属等益生菌定植数量少；极早产儿生后7～28天肠道菌群多样性呈下降趋势。了解极早产儿生后早期的肠道菌群特征，针对性进行精准干预可能为极早产儿近远期并发症的防治提供新思路、新靶点。

参考文献:

[7]黎杰勇,何志勋,王伟名,等.益生菌预防极低出生体重儿迟发型败血症的meta分析[J].中国当代儿科杂志,2021, 23(6):599-607.

[31]谢雅静,时晓敏,颜世敢,等.肠道菌群与精神类疾病相关性研究进展[J].中国药理学通报, 2022, 38(11):1617-1622.

基金资助:2021泉州市医疗卫生领域指导性科技计划项目(No.2021N087S);

文章来源:许景林,李华梅,傅春燕,等.极早产儿生后1个月肠道菌群的动态变化及分布特征[J].临床儿科杂志,2024,42(04):311-317.