根据世界卫生组织(WHO)最新发布的全球癌症统计报告，恶性肿瘤仍是人类70岁之前最常见的死因[1]。目前肿瘤的传统治疗手段包括手术切除、放射治疗、化学治疗等。手术切除对于肿瘤晚期特别是伴远处转移的患者并不适用，传统的放射治疗和化学治疗虽适用于大多数肿瘤，但其不良反应会给患者带来伤害[2,3]。此外，由于肿瘤的异质性，并非所有肿瘤细胞对常规的放化疗都具有相同的敏感性，未被有效清除的癌细胞是癌症复发的关键驱动因素。肿瘤异质性是指同一种恶性肿瘤在不同患者个体间或者同一患者体内不同部位的肿瘤组织中存在不同类型的亚克隆细胞，它们在分化程度、侵袭转移能力以及对药物的反应性等方面均有差异[4]。肿瘤的异质性给肿瘤的治疗带来巨大困扰，为了能针对性制订临床治疗方案，有效提升临床治疗效果，需要对肿瘤异质性的生物学特性进行深入了解。

基因组学和表观遗传学改变与肿瘤异质性的发生密切相关，近年来，基因测序技术的迅速发展，使临床医生对肿瘤在分子生物学层面上的认识得到突破性提高[5,6,7,8]。二代测序技术(NGS)的出现，解决了原有基因测序技术通量低、成本高等问题，加快了研究者们探索肿瘤异质性的脚步，为肿瘤患者制订个体化治疗方案、筛选靶向药物等奠定了坚实的基础。本文将对NGS及其在常见恶性肿瘤治疗中的应用进展进行综述。

1、NGS

随着分子生物学技术的发展，人们对疾病的研究逐渐聚焦于全基因组方向。测序技术的出现，为人们深入探索基因的结构和功能提供了有力手段。传统的分子诊断方法，如免疫组织化学检测(IHC)、聚合酶链反应(PCR)和荧光原位杂交检测(FISH)等，由于检测应用范围窄、通量低、数据产出低、时间成本高、样本需求量大等自身局限性，影响临床诊疗的使用效率[9,10]。

NGS又称高通量测序、大规模平行测序，是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。相较于采用合成终止测序的一代测序技术，NGS引入了可逆终止末端，实现了边合成边测序，可以同时读取数以千计DNA片段，极大地提升了检测效率。NGS的基本原理是在DNA片段扩增时，从中捕捉新添加的碱基所携带的荧光信号，进而确定DNA的序列[9]。NGS解决了一代测序技术存在的耗时长、通量低等问题，使基因检测的效率得到大幅提升，被广泛运用于生命科学的研究中[9]。

近年来有研究显示，NGS在恶性肿瘤的研究与临床应用中，通过对肿瘤相关基因进行筛查，可以发现罕见的基因突变以及融合基因等异常，从中挖掘治疗靶点，选择靶向药物，并追踪患者在治疗过程中肿瘤的演变特征，甚至能够对患者的预后及复发率进行评估[7,8,11,12]。本文将围绕NGS在常见恶性肿瘤治疗中的应用及进展进行综述。

2、NGS在恶性肿瘤治疗中的应用进展

2.1 乳腺癌

乳腺癌是女性患者最常见的一种恶性肿瘤，是45岁以下女性恶性肿瘤死亡的首要原因[1]。乳腺癌具有高度肿瘤异质性，发病机制尚不明确。研究者们运用对乳腺癌基因组和分子生物学方面的知识，发现了筛查乳腺癌的生物标志物，研发出基于基因突变位点的靶向治疗药物[13]。因此，应用NGS对乳腺癌患者进行基因测序，可以协助临床医生进行乳腺癌的早期筛查、针对性制订和调整治疗方案。

NGS的出现为大规模筛查乳腺癌关键驱动基因提供了更便捷的手段。基于NGS的全面基因组测序(CGP)技术可涵盖具有临床价值的基因，在基因变异检测上具有较高的敏感性，能够非常准确地呈现测序结果[14]。ROSS等[14]利用CGP技术对8 654例乳腺癌患者的基因数据进行分析，结果显示，80.4%患者至少有1条信号通路发生基因突变，超过一半的患者可能由于基因突变而对特定的信号通路抑制剂敏感。利用CGP技术可以发现特定靶基因的改变，临床可通过这些改变预测患者对特定治疗方法的敏感性；通过NGS筛查关键信号通路是否突变，从而有针对性地制订个体化治疗方案。

有研究表明，循环肿瘤DNA(ctDNA)可对乳腺癌患者在新辅助化疗(NAC)中的反应和预后进行预测[15,16,17]。但早期患者血液中的ctDNA水平通常较低，常规检测方法会受到一定限制，NGS具有高敏感、样本消耗少等优点，运用NGS检测ctDNA,在提示早期乳腺癌患者根治性术后存在微小残留病灶(MRD),以及预测疾病复发等方面均显示出较好的临床应用价值[18]。MAGBANUA等[17]从84例高危早期乳腺癌患者在不同治疗时期采集的血液中提取出游离DNA,通过NGS检测治疗前后患者的血液中ctDNA的变化。结果表明，ctDNA清除不足是治疗效果不佳和肿瘤转移与复发的显著预测因素。由此可见，ctDNA测序结果是乳腺癌NAC疗效和转移性复发的重要预测因子，在患者NAC期间对其ctDNA水平变化进行监测，有助于实时评估治疗反应，及时改善治疗方案。

综上所述，NGS在乳腺癌的筛查、个体化治疗等方面发挥了巨大作用。

2.2 肺癌

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，也是男性患者中最常见的恶性肿瘤[1]。根据病理组织学可将肺癌大致分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类[19],其中NSCLC约占80%～85%。作为一种异质性疾病，肺癌的病变过程与基因组的改变紧密相关。其中，表皮生长因子受体(EGFR)对细胞增殖和凋亡信号通路的改变是NSCLC发生的重要原因。有研究表明，EGFR突变是NSCLC已知的治疗靶点，19号外显子的缺失突变和21号外显子的点突变是最常见的突变类型，约占EGFR突变类型的85%以上[20],因此，临床可以通过检测EGFR的突变预测NSCLC患者对靶向药物的反应性。对EGFR突变的检测，早前常依赖于一代测序，虽然它能够检测特定基因组区域内的所有突变，但当样本中肿瘤细胞富集不足时，存在较大假阴性风险[21]。突变特异性PCR试剂盒虽能检测肿瘤细胞含量低至1%～5%的样本[22],但目前可用的PCR试剂盒不能充分覆盖EGFR突变类型[23,24],可能会遗漏潜在的可用于指导选择靶向药物的EGFR位点改变。

随着NGS的出现，EGFR罕见突变的检出率也逐步提高。作为一种高灵敏的技术，NGS可对罕见基因突变进行分子评估，还能从不同患者的样本中检测到多个热点基因，具有更高的诊断准确性，且节省了样本周转时间[24]。目前，常用的NGS检测组合已能同时分析包括EGFR在内的大量与临床相关的热点基因[25]。

EML4-ALK融合基因是NSCLC靶向治疗的重要靶点[26]。ALK抑制剂可以抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。最初对ALK基因重排检测依赖于FISH技术，但该方法较为复杂，对标本质量和设备要求高，目前正逐步选用其他方法补充或替代FISH技术。基于NGS所设计的专门用于检测融合基因的方法，还可以进行更为复杂的基因重排分析，在实际应用中展现出良好的性能[27]。

此外，KRAS、BRAF、NTRK等是NSCLC中变异率相对较低的驱动基因。针对这些基因变异的靶向药物仍处于前瞻性临床研究阶段。传统的检测方法不能完全覆盖上述基因的突变类型，而基于NGS的检测可以满足相关需求。

随着NGS在肺癌诊疗中的应用，会极大促进了肺癌分子生物学研究，同时为患者在诊断、用药指导等方面提供强有力的支持。

2.3 结直肠癌(CRC)

CRC是世界第三大常见的恶性肿瘤[1]。CRC的主要治疗方式为手术切除，但对于中晚期患者来说，往往需要加入常规化疗或靶向药物治疗。NGS技术为CRC的靶向药物选择提供了实验室支撑。利用NGS检测CRC患者中KRAS/NRAS/BRAF的突变，得到了美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的《结直肠癌临床实践指南》的推荐：所有转移性CRC患者均应进行RAS和BRAF突变的基因分型，可以单独检测，也可以作为NGS检测组合的一部分进行检测[28]。

靶向治疗和常规化学治疗产生药物耐受的重要机制之一是肿瘤内异质性(ITH)。研究者们对NGS测得的核苷酸序列进行深入分析，结合突变-等位基因肿瘤异质性(MATH)评分来衡量ITH的程度，为CRC治疗方案提供指导[29]。GREENBAUM等[30]通过NGS对超过400个癌症相关基因进行检测，分析直肠癌患者MATH得分与NAC治疗效果之间的关系。结果表明，MATH得分与NAC疗效成反比，分数越高则疗效越差。因此，利用NGS结合MATH评分来对ITH程度进行评估，有利于为患者选择恰当的治疗方案。

微卫星高度不稳定性(MSI-H)常用来判断CRC的化疗效果以及预后评估。但反映MSI状态的DNA序列在肿瘤组织中含量很低，NGS在MSI的检测方面具有明显的优势，该技术可一次性捕获多段基因组序列，在对肿瘤进行基因分型、检测驱动基因变异的同时，完成对MSI的状态评估，极大地提高了低含量样本的分子诊断效率。此外，基于ctDNA的MSI-NGS也逐步应用到临床，为病理组织取样困难的患者提供更多选择[31]。随着NGS在CRC临床应用中的拓展，将有助于CRC的早期诊断、治疗、判断疗效及预后评估。

2.4 白血病

白血病是一组具有异质性的血液系统恶性肿瘤，以造血干细胞恶性增殖，引起白血病细胞浸润组织器官为特征，继而影响人体正常造血功能。化学治疗和造血干细胞移植是白血病常用的治疗手段，近年来，NGS逐步在白血病分子靶向治疗药物的研发和选择中起到指导作用[32,33,34]。

急性髓系白血病(AML)是正常髓系造血干细胞基因突变所致，在成人急性白血病中多见。由于测序技术的进步，研究者们得以更深入地了解AML的基因突变情况，NGS的出现为AML的分型、治疗方案选择、预后评估等方面提供了重要帮助[35]。白血病细胞存在成百上千种基因突变类型，但只有少数关键基因突变会导致AML发生。通过NGS筛选出的AML相关突变基因包括NPM1、RUNX1、FLT3、TP53、IDH1/2、ASXL1等，已被欧洲白血病网纳入为AML的治疗靶点[36]。选择基于这些靶点研发的分子靶向药物进行治疗能提高AML患者的疗效。例如二代FLT3激酶抑制剂喹扎替尼，临床试验表明，它对难治性AML疗效确切，完全缓解率可达44%,目前该药联合标准化疗方案仍处于试验阶段，有望成为合并FLT3突变的AML患者的较好选择[37];针对IDH1/2突变的靶向药物恩西地平和艾伏尼布在治疗IDH1/2突变的初发AML的研究中也已取得显著成果[37]。同样，包括FLT3抑制剂、IDH抑制剂、RUNX1抑制剂等在内的AML治疗药物的选择，都可通过NGS来提供实验室支撑。

NGS在急性淋巴系白血病(ALL)的靶向药物选择方面也提供了较大帮助。融合基因的产生是ALL最常见的基因突变类型[38]。针对BCR-ABL融合基因的TKIs(伊马替尼、泊那替尼)和JAK抑制剂(卢克替尼)等已被证实对存在BCR-ABL突变或Ph+的ALL患者具有疗效[32]。NGS在大型基因检测中的应用能较全面地识别ALL患者的基因突变情况，为寻找潜在治疗靶点带来更多可能，也为ALL治疗方案的选择指明方向。

MRD指肿瘤患者经过治疗后体内仍残留少量肿瘤细胞，是对患者疗效和预后进行评估的重要指标，快速、准确地检测MRD是白血病治疗过程中的关键环节[39]。常规检测MRD多利用实时定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)[40],但有研究表明，NGS在该项检测中灵敏度更高[34]。KOTROVA等[41]对76例患者分别通过NGS和RT-qPCR检测得到的MRD结果进行比较，发现NGS能够更精确地预测疾病复发率，还能够提供关于B淋巴细胞重排等信息。虽然NGS还尚未常规用于MRD的检测，但此技术的临床应用价值已获得国内外专家的认可[42]。

可以预见，随着NGS应用的拓展，白血病的治疗前景也将愈加广阔。

2.5 其他肿瘤

此外，NGS技术在多种恶性肿瘤的治疗中都发挥着作用。85%的鼻咽癌患者均存在EGFR高表达[43],NGS在鼻咽癌发病机制的研究和靶向治疗药物的选择上能提供有力支持。前列腺癌是男性第二高发癌症[1],利用NGS对前列腺癌患者进行深度测序，可以更加清晰地阐明影响前列腺肿瘤发生的机制，加深人们对前列腺癌生物学特性理解[44],为治疗方案的选择提供参考。甲状腺癌是一种常见的内分泌肿瘤，BRAF突变使甲状腺结节恶性风险高达99.8%,针对甲状腺癌的分子检测已从单基因BRAF检测发展到多基因多位点变异分析，NGS可以更全面、高效地检测到基因突变类型，为甲状腺癌相关基因谱的完善做出贡献[45]。

无论是探索疾病的发病机制还是寻找更精确的治疗靶点，都离不开对突变基因进行深入分析，NGS作为一种高效、灵敏且全面的检测方法，在其中的作用越来越明晰。

3、总结与展望

随着NGS在科学研究和临床诊疗中的应用愈发广泛，人们可以更高效地获取肿瘤细胞基因的结构、表达水平等遗传信息，有利于肿瘤发病机制的研究；还能更全面地检测目标基因的变异，为靶向药物的研发和选择提供巨大的支持。但是，NGS对检测设备要求较高，中小型医院一般不具备开展NGS检测的条件，此外，该技术的应用必将产生大量的生物信息数据，对患者的个人隐私也会造成一定威胁。不过笔者仍然相信，随着科技与经济的快速发展、政策的不断完善，NGS在恶性肿瘤治疗中的创造的价值会更加璀璨。

参考文献:

[18]王文娜,马飞,徐兵河.循环肿瘤DNA应用于乳腺癌的潜在价值探索[J].癌症进展,2016,14(10):933-937.

[19]国家卫生健康委办公厅.原发性肺癌诊疗指南(2022年版)[J].协和医学杂志,2022,13(4):549-570.

[31]袁瑛.结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识[J].实用肿瘤杂志,2019,34(5):381-389.

[34]王平,苟阳,彭贤贵,等.专家共识解读:二代测序如何辅助血液肿瘤的临床诊治[J].海南医学,2019,30(21):2721-2724.

[37]金洁.急性髓细胞白血病的新药治疗[J].临床血液学杂志,2019,32(3):174-176.

[44]李妍,徐兴祥.第二代测序技术在实体瘤诊治方面的研究进展[J].现代肿瘤医学,2018,26(24):4035-4042.

[45]罗定远,廖健伟.甲状腺癌基因检测与临床应用广东专家共识(2020版)[J/CD].中华普通外科学文献(电子版),2020,14(3):161-168.

基金资助:重庆市科卫联合医学科研项目(2021MSXM095);

文章来源:唐薇,侯玉磊,陈辉.二代测序技术在肿瘤治疗中的应用进展[J].国际检验医学杂志,2023,44(21):2654-2658.