糖尿病是一种以血糖异常升高为主要特征的代谢性疾病,当病变累及肾脏微血管时,可导致弥漫性或结节性肾小球硬化,最终发展为糖尿病肾病。DN可明显增加糖尿病患者的致残率、致死率,也是目前引起终末期肾脏疾病的主要原因[1]。DN临床上常以持续性白蛋白尿、高血压、水肿、肾病综合征及肾功能异常为主要表现[2],发病机制目前虽尚未完全清楚,但肾近端小管上皮细胞的凋亡在DN的发病和发展中起着至关重要的作用[3]。研究表明,氧化应激、糖脂代谢、细胞因子炎症反应等多种复杂机制相互作用,参与DN的发病过程[4,5,6]。中医学认为,DN为消渴病中后期的变证之一,多为阴阳俱损、阳虚水泛之征象,属本虚标实之证。五苓散是治疗太阳蓄水证的代表方。临床研究表明,五苓散能有效减轻水肿、改善脂质代谢,同时能增加尿量、有效减少蛋白尿[7];五苓散加减治疗DN能改善肾脏功能,缓解DN引起的水肿[8,9]。

网络药理学作为一门融合了药理学、生物信息学、系统生物学的新兴学科,可以通过构建“疾病-靶标-药物”网络从整体角度分析药物与机体的作用机制,被认为是探索中药复方机制的新视角、新途径[10,11]。本研究基于网络药理学的相关原理及方法,分析五苓散及DN的有效成分及靶点,并对筛选出来的主要靶点及通路进行预测分析,以探讨五苓散治疗DN的可能作用机制。

1、材料及方法

1.1五苓散药物成分筛选及靶点预测

中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)是目前国内较为完善的中药成分靶点数据库,收录了《中华人民共和国药典》[12]500种药物以及每味中药的成分信息,且包含每一个化合物的吸收、分布、代谢和排泄等数据[13]。利用TCMSP数据库检索五苓散中白术、泽泻、茯苓、猪苓、桂枝5味药的全部化学成分,并以口服生物利用度(OB)≥30%及类药性指数(DL)≥0.18[14]作为筛选标准,确定药物的活性成分;将从TCMSP数据库筛选出的五苓散功能富集的每个活性成分对应的潜在靶点信息放入UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)中检索,得到所有靶点的基因名。

1.2DN相关靶点获取

通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/)、DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)以“diabeticnephropathy”为关键词检索并收集DN相关的基因,对收集的疾病靶点进行处理,删除重复的靶点,即得到DN的相关靶点。

1.3五苓散-DN交集靶点筛选

利用Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具对五苓散活性成分靶点与DN相关靶点基因进行映射,并得到交集靶点。

1.4构建药物-成分-靶点-疾病网络

将以上所得数据导入Cytoscape3.7.2软件,并对其参数进行设置后得到药物-成分-靶点-疾病相互作用网络图。对系统网络进行分析,以便进一步了解五苓散作用于DN的药理机制。

1.5构建蛋白质相互作用网络(PPI)

将筛选得到的“Drug-Disease”中的靶点蛋白导入STRING11.0数据库(https://string-db.org/)进行蛋白与蛋白的相互作用分析,限定研究物种为“Homosapiens”,最低相互作用评分设置为“0.400”,同时显示设置隐藏游离点,其余参数保持默认设置,得到PPI图。

1.6GO分析与KEGG通路富集分析

DAVID6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)是一个在线基因和通路功能注释的数据库。运用DAVID6.8数据库及KOBAS3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)将得到的核心靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要用于描述基因靶点的功能,包括细胞组成、分子功能和生物学过程。KEGG通路富集分析可以得到五苓散与DN共同靶点所富集的信号通路。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析皆以P<0.01为筛选标准。

2、结果

2.1药物、疾病靶标预测结果

通过TCMSP数据库共检索到五苓散5味药已报道的成分有386个,其中泽泻46个、白术55个、茯苓34个、猪苓31个、桂枝220个。以“OB≥30%,DL≥0.18”为参数进行筛选,去重后共得到有效靶点46个,OB值前10位有效靶点见表1。通过GeneCards、OMIM数据库共检索到2418个DN相关靶点基因。

2.2药物-成分-靶点-疾病相互作用网络

将46个化合物靶点与DN相关靶点基因进行映射,得到19个药物-疾病共同靶点基因。利用Cytoscape3.7.2软件构建药物-成分-靶点-疾病相互作用网络。网络中有41个节点(其中包含20个化合物节点,21个靶基因节点)和79条边。其中方形节点表示靶基因,椭圆形节点表示活性化合物,每条边则表示五苓散与其活性成分、活性成分与成分作用靶点、疾病与作用靶点之间的相互作用关系。见图1。

表1五苓散组成药物化合物的有效靶点基本信息(OB值前10位)

图1五苓散治疗糖尿病肾病药物-成分-靶点-疾病相互作用网络图

2.3PPI网络及其关键靶点

将映射得到的19个交集靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析,软件分析后保留有意义的节点18个,边共39条,平均节点度值为4.11,PPI富集P<0.01,见图2。

图2五苓散治疗糖尿病肾病药物-疾病交集作用靶蛋白相互作用网络图

将数据导入Cytoscape3.7.2软件中,使用NetworkAnalyzer插件对网络进行分析,见图3。图3中的节点大小表示度值的大小,节点越大对应的度值越大;边的粗细表示合并分数,边越粗合并分数值越大,表示该节点蛋白与其他节点作用网络越广泛。

图3五苓散治疗糖尿病肾病药物-成分-靶点-疾病交集靶点相互关系图

网络中各节点的平均度值为4.33,取度值超过平均值的靶点9个(见表2),推测这些靶点可能是五苓散治疗DN的关键靶点。

表2五苓散治疗糖尿病肾病关键靶点基本信息

2.4GO功能富集分析结果

将作用靶点进行GO功能富集分析,结果表明,在生物学过程方面,主要参与了细胞对脂质的反应、脂质反应、细胞对有机环状化合物的反应、细胞对刺激激素的反应、细胞对类固醇激素刺激的反应等生物过程;在分子功能方面,主要参与脂质结合、转录激活子活性,RNA聚合酶Ⅱ核心启动子近端区域序列特异性结合、类固醇结合、类固醇激素受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性等分子功能;在细胞组成方面,主要存在于细胞质部分、胞质溶胶、细胞质、脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒等细胞组分中。选取这3个过程中排名前5者列为表3。

2.5KEGG通路富集分析结果

进行KEGG通路富集分析,得到通路142条(P<0.05),根据P值由小到大进行排列,选取前20条通路进行部分展示,见表4。其中涉及细胞凋亡通路、乙肝通路、癌症通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路、凋亡-多种等多种信号通路。

3、讨论

DN属于中医学“消渴”“肾消”“水肿”等范畴。《圣济总录》记载:“消渴病久,肾气受伤,肾主水,肾气虚衰,气化失常,开阖不利,能为水肿”[15];《证治要诀》言:“三消久而小便不臭及作甜气,在尿中滚涌,更有浮在溺面如猪脂,此精不禁真元竭矣”,均提示DN是糖尿病的进一步发展。五苓散具有温阳解表、化气行水的作用,方中泽泻、茯苓、猪苓三者合用以淡渗利水;桂枝量小力专,通阳化气以行水,引诸利湿药直达病所;白术健脾化湿以利水,与茯苓、桂枝合用可使气化有常,精微输布。该方药简力专,临床广泛用于治疗太阳蓄水证。

本研究基于网络药理学,将通过数据库筛选的五苓散有效靶点与DN的相关靶点进行映射并取交集,得到药物-疾病共作靶点19个。将其进行蛋白质相互作用网络分析,得到关键靶点9个,分别为CASP3、RELA、CASP8、ESR1、AR、BCL2、CASP9、NR3C1、ICAM1。而在9个关键靶点中,CASP3、CASP8、CASP9皆为天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(Caspases)家族蛋白。Caspases家族是细胞凋亡过程中的关键元件,其激活与超常表达均可引起细胞凋亡,故又称死亡蛋白酶,可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[16]。CASP8作为凋亡起始者,参与细胞凋亡的起始。在外源性激活途径中,CASP8是关键的启动型Caspase。研究表明,CASP8几乎能激活所有凋亡级联反应下游的Caspase而诱发凋亡[17,18]。CASP8的激活亦可启动细胞内途径,并且细胞外途径可以间接作用于细胞内途径[19],共同引起启动型Caspase的活化,活化的CASP8、CASP9又可激活CASP3,继而启动Caspase级联反应,诱导细胞凋亡。CASP3位于凋亡有序级联反应的下游,是细胞凋亡的关键执行者,是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[20];并且大多数触发细胞凋亡的因素,最终均需通过CASP3介导的信号传递途径致使细胞凋亡。傅永锦等[21]研究显示,CASP3的激活可启动细胞凋亡,导致DN的发生与发展。孙文等[22]认为,CASP3是氧化应激引起足细胞凋亡损伤的重要细胞因子。当足细胞CASP3基因表达受到抑制时,能改善DN患者肾功能、减轻肾脏病理损害。综上所述,五苓散可能通过抑制CASP8、CASP3的激活来抑制细胞凋亡相关通路反应的发生,减轻肾脏损害,延缓DN的发展。

表3五苓散治疗糖尿病肾病作用靶点的GO功能富集分析结果

表4五苓散治疗糖尿病肾病KEGG通路富集潜在靶点信息

B淋巴细胞瘤2家族蛋白在细胞凋亡中的作用可根据结构和功能[23]分为两类:一类是抗凋亡因子BCL2,一类是促凋亡因子Bax,其中BCL2是抑制细胞凋亡的主要基因[24]。BCL2与Bax可分别以同源二聚体形式存在,也可互相结合形成异源二聚体,阻断细胞色素C释放,抑制CASP3蛋白的活化,进而有效抑制细胞凋亡[25]。BCL2是miR-204的靶基因,miR-204可以通过靶向下调抗凋亡蛋白BCL2的表达从而促进足细胞凋亡,加快DN的发生发展,增加DN的发病风险[26]。由此可见,五苓散可能是通过调节凋亡相关通路上的Caspase蛋白家族以及BCL2来抑制细胞凋亡,保护肾脏,延缓DN的发展。

RelA(p65,NF-κB3)是核因子-κB(NF-κB)蛋白家族中的一个转录因子[27]。在糖尿病状态下NF-κB可被激活[28],而在高血糖情况下NF-κB活动显著增强,导致转化生长因子β(TGF-β)、趋化因子等细胞因子的释放[29]。此外,过度激活的NF-κB会进行各种基因异常转录并参与血管并发症。NF-κB也会导致血小板源生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β等基因的表达,导致血管细胞损伤和血管生成[30],加速DN的发生。NF-κB在细胞因子网络调节中发挥转录调控作用,糖尿病状态下葡萄糖自身氧化、蛋白非酶糖基化终末产物生成、多元醇途径活性增强等均可导致NF-κB的激活、堆积,NF-κB活化后可诱导诸多炎症因子的转录,诱导蛋白尿增加、肾小球硬化及小管间质纤维化[31]。王铮等[32]研究发现,DN炎症信号传导通路的激活以及各种细胞因子的介导调节着DN进展中炎症反应过程。可见五苓散可能是通过调节TNF、NF-κB信号通路等与炎症密切相关信号通路上的NF-κB因子来抑制炎症因子的产生,从而延缓DN进展中的炎症反应过程。

通过GO功能富集分析可知,五苓散治疗DN效应的发挥主要在细胞质、脂蛋白颗粒、细胞器等细胞组分上;涉及分子功能包括脂质结合、半胱氨酸型内肽酶活性等酶分子结合过程,RNA、DNA结合过程以及酶活性参与凋亡过程;主要参与脂质反应、细胞凋亡调控、激素反应等生物学过程。可见其效应发挥所在细胞场所与其功能过程相一致,在细胞质中进行脂质结合、酶分子结合,并在细胞器的线粒体中进行RNA、DNA结合,进而参与脂质反应、细胞凋亡调控等多种生物学过程。

通过KEGG通路富集分析进一步说明,五苓散的靶点成分与DN的相关通路关系密切。细胞凋亡通路、乙肝通路、癌症通路的富集基因皆有CASP3、CASP8、CASP9、BCL2、RELA,且其中的CASP3、CASP8、CASP9、BCL2皆为细胞凋亡相关蛋白,并且显著性较高的前20条信号通路上出现的靶点也具有极大的相似性,重复率较高。Caspase蛋白家族出现的频率高达90%,有50%的通路同时出现CASP3、CASP8、CASP9基因。BCL2出现的频率达75%,有60%的通路出现了RELA,并且前3条通路的上述Caspase蛋白家族、BCL2、RELA出现率为100%。可见Caspase蛋白家族、BCL2、NF-κB等靶点在治疗DN中起到尤为关键的作用。

本研究发现,五苓散可能通过调控CASP3、CASP8、CASP9等Caspase及BCL2家族蛋白等细胞凋亡相关蛋白来抑制肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小球内皮细胞及足细胞等肾脏细胞的凋亡,从而起到延缓DN发生发展的作用;同时可能通过调控细胞凋亡通路,以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE、TN、NF-κB信号通路等炎症信号通路与PI3K-Akt信号通路等多条通路上的不同靶点来延缓DN病程的发展。但是富集通路上细胞凋亡相关基因这一类核心基因出现频次的重复性,可以反映出五苓散在治疗DN靶点上的专一性,这也为五苓散治疗DN的进一步实验研究与临床应用提供了新方向。

参考文献：

[4]林子桐,张超,沈雪梅.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2014,28(5):765-773.

[5]李敏州,高彦彬,马鸣飞,等.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(22):344-349.

[7]昝俊杰.加减五苓散对成人原发性肾病综合征水肿患者血清醛固酮影响的临床研究[D].武汉:湖北中医药大学,2019.

[8]郝晓博.五苓散加减治疗糖尿病肾病49例[J].河南中医,2017,37(10):1715-1717.

[9]李姗姗,闫镛.闫镛教授经方论治糖尿病验案举隅[J].中国民族民间医药,2019,28(16):81-83.

[10]陈海彬,周红光,李文婷,等.网络药理学:中药复方作用机制研究新视角[J].中华中医药杂志,2019,34(7):2873-2876.

[12]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[13]汝锦龙.中药系统药理学数据库和分析平台的构建和应用[D].咸阳:西北农林科技大学,2015.

申鑫惠,杨宇峰,石岩.五苓散治疗糖尿病肾病潜在靶点及作用机制的网络药理学研究[J].中医杂志,2020,61(24):2190-2196.