当今社会工作压力大、过度劳累、熬夜及不良生活习惯等易造成男性不育，且男性不育的发生率呈逐年上升趋势。其中少精子症是一种较常见的男性不育症，其精子浓度(SC)<1.5×107/mL或每次射精的精子总数<3.9×107。较多的不孕不育的夫妇深受该病困扰，影响社会稳定与家庭和谐[1,2]。前期研究表明，少精子症的发生受多种基因调控，主要通过脂肪酸合成酶(Fas)、P53、B淋巴细胞瘤-2基因家族(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)基因家族控制，其中凋亡相关因子Fas/脂肪酸合成酶配体(FasL)信号通路过度表达，启动程序性细胞死亡，对精子数量和质量产生不利影响[3,4]。但是现代医学对Fas/FasL信号通路难以调控，而相关研究表明，中医药对其有一定的调控作用[3,5]。本研究应用桂药生精胶囊治疗少精子症取得了良好的疗效，且发现该药对Fas/Fasl信号通路有调控作用。现报道如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年10月至2020年3月就诊于广西中医药大学附属瑞康医院男性科门诊的少精子症(肾精亏虚型)患者60例，随机分为对照组和治疗组，每组30例。治疗组年龄为26～42岁，病程为13～17个月。对照组年龄为25～45岁，病程为13～18个月。两组患者年龄、病程比较，差异无统计学意义(P<0.05),具有可比性。纳入标准：(1)符合西医少精子症的诊断标准。①5.0×106/mL≤SC<1.5×107/mL且每次射精的精子总数<3.9×107。②前向运动精子比例(PR)≥32%或精子总活力[PR+非前向运动精子比例(NP)]≥40%。③pH值为7.2～7.8。④精液量≥1.5 mL且60 min内完全液化成灰白色精液。(2)进行精液分析检查，确诊为少精子症。(3)符合中医肾精亏虚型辨证标准。主症为精子总数减少、腰膝酸软、性欲淡漠、婚后不育，次症为头晕、脉沉细弱、耳鸣、健忘、精神萎靡、失眠多梦、足跟疼痛、舌淡苔白、乏力。具备主症第1项和其他任意1项主症，同时具备次症2项及以上即可诊断为少精子症(肾精亏虚型)。(4)年龄为25～50岁的已婚男性。(5)入组前90 d内未服用促进生精的药物。排除标准：(1)配偶患有不孕症；(2)工作环境常接触射线或高温；(3)先天睾丸发育不良、精索静脉曲张Ⅱ度及以上、精路梗阻、睾丸萎缩；(4)男性生殖系统感染；(5)实验室检查肝、肾功能和血糖异常；(6)服用抗癫痫、抗肿瘤等有碍生精及精子活力的药物；(7)近3个月内参与了其他临床试验；(8)有不良生活习惯，如酗酒、吸毒、经常洗桑拿和长期熬夜；(9)不配合治疗；(10)不配合随访；(11)治疗过程中出现不良反应。本研究通过广西中医药大学附属瑞康医院医学伦理委员会审批(KY2019-047),且所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

ST-360酶标仪购自上海科华公司，LineGene 9600 聚合酶链反应仪购自杭州BIOER公司，SAS-Ⅱ精子质量分析仪购自北京赛司医疗科技有限公司，Fas 酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒和FasL ELISA 测定试剂盒均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司，Trizol裂解液购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒均购自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法

对照组患者口服东北制药集团沈阳一制药有限公司生产的左卡尼汀(国药准字H19990372),每次1.00 g, 每天3次，1个疗程需治疗12周。治疗组在对照组的基础上口服桂药生精胶囊(广西中医药大学附属瑞康医院药物研发基地制备，Z01060147),每粒0.35 g, 每次3粒，每天3次，12周为1个疗程。

1.3.2 检测方法

所有研究对象禁欲2～7 d, 清洗手和阴茎，戴薄膜检查手套手淫、按摩，采集1次射精的全部精液于无菌精液收集杯内，置于37 ℃恒温箱中孵育，液化后用SAS-Ⅱ精子质量分析仪进行精液常规检查。将剩余的精液样本从生物安全柜中全部转移进5 mL的无菌试管内，离心吸取上层精浆1 mL于V型离心管中，置于-80 ℃环境中保存待测。采用ELISA检测Fas蛋白、FasL蛋白表达水平，将分离的精浆以4 000 r/min的速度离心10 min, 取上清液按照Fas ELISA试剂盒和FasL ELISA试剂盒的操作步骤定量检测Fas蛋白、FasL蛋白表达水平。

将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，用1 mL PBS重悬混匀，沿试管壁轻轻加入提前准备好的80%聚乙烯吡咯烷酮(Percoll)+40%Percoll密度梯度液，以3 000 r/min的速度离心20 min留取80%Percoll分层液下离心管底部的精子转入V型离心管，用PBS洗涤后加入200 μL PBS重悬，加入1 mL Trizol裂解液振荡混匀，室温静置5 min, 然后置于-80 ℃冰箱中保存待检，采用RT-PCR检测Fas信使RNA(mRNA)、FasL mRNA表达水平。采用Trizol法提取总RNA,分别使用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的纯度、浓度和完整性。纯度、浓度和完整性都符合要求的RNA样本立即用反转录试剂盒将RNA反转录为互补DNA(cDNA),并参照RT-PCR试剂盒说明书和引物的检测报告书进行RT-PCR定量检测。引物由大连宝生物工程有限公司设计、合成、验证。GAPDH基因的正向引物序列为5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′,反向引物序列为5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′,引物长度为205 bp。反应条件：95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 40个循环，60 ℃ 读取荧光值。Fas基因的正向引物序列为5′-GGGTGGCTTTGTCTTCTTCTTTT-3′,反向引物序列为5′-CCTTGGTTTTCCTTTCTGTGCT-3′,引物长度为101 bp; FasL基因的正向引物序列为5′-GTCCTTGACACCTCAGCCTCTA-3′,反向引物序列为5′-GCACTGCTGTCCACCCAGTA-3′,引物长度为 134 bp。反应条件：95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 62 ℃ 30 s, 40个循环，60 ℃读取荧光值。3对引物的溶解条件：95 ℃ 5 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 10 s。采用2-ΔΔCt法计算Fas mRNA、FasL mRNA的表达水平。

1.3.3 临床疗效评价

临床疗效评价标准。治愈：治疗期间及治疗后3 个月内，其配偶怀孕；显效：治疗后SC≥1.5×107/mL或一次射精精子总数>3.9×107/次，且精液常规检查的其他参数均在正常范围内；有效：在治疗后SC较治疗前提高≥30%;无效：治疗前后对比，SC均较治疗前提高<30%或SC无改变或降低。总有效率=(治愈例数+显效例数+有效例数)/总例数×100%。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以

表示，两组间比较采用独立样本t检验，两组内比较采用配对t检验。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 两组患者总有效率比较

治疗组总有效率比对照组高(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者总有效率比较[n(%)]

2.2 治疗前后两组患者精液常规参数比较

治疗前两组患者SC、PR、PR+NP和精子总数比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组患者精子SC、PR、PR+NP和精子总数均比治疗前升高(P<0.05),且治疗组患者精子SC、PR和精子总数高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 治疗前后两组患者精液常规参数比较

2.3 治疗前后两组患者精浆Fas蛋白、FasL蛋白表达水平比较

治疗前两组患者精浆Fas和FasL蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组精浆Fas蛋白表达水平低于治疗前(P<0.05),且治疗组Fas蛋白表达水平低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 治疗前后两组患者精浆Fas蛋白、FasL蛋白表达 水平比较

2.4 治疗前后两组患者精子Fas mRNA、FasL mRNA表达水平比较

治疗前两组患者精子Fas mRNA 和FasL mRNA表达水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组患者精子Fas mRNA和FasL mRNA表达水平低于治疗前(P<0.05),且治疗组Fas mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 治疗前后两组患者精子Fas mRNA、FasL mRNA表达水平比较

3、讨论

少精子症的发生是由于精子生成的微环境稳态受到破坏，导致精子生成减少或凋亡增多[6]。精子细胞的凋亡受多个基因控制，主要有Fas、P53、Bcl-2和Caspase基因家族等，其中Fas/FasL信号通路的传导是死亡受体信号传导途径的关键组成，在正常生理过程中，该通路维持着精子正常的密度和活力[7,8,9];在病理情况下，FasL与Fas抗原结合，激活Fas相关死亡域，向细胞内传递凋亡信号，启动程序性细胞死亡，其凋亡过度会导致精子数量、活动率下降和畸形精子产生[10]。西医在治疗少精子症方面缺乏有效药物，而中医药治疗少精子症通过辨证论治，采用填精补肾法治疗具有较好的疗效[11,12]。近期有研究表明，肾精亏虚型少精子症患者口服五子衍宗丸可下调Caspase-3基因的表达水平从而提高的精子活力和精子总数[13]。桂药生精胶囊不仅能上调不育症大鼠睾丸组织Bcl-2基因表达水平，而且能下调Bax基因、Caspase-3基因和Caspase-9基因表达水平，促进睾丸组织病理损伤的修复，最终恢复精子生成的微环境，提高大鼠的精子质量[14];还有研究发现，少精子症患者精子中 的Fas基因和FasL基因的表达水平均显著升高，而关于精浆Fas蛋白和FasL蛋白表达水平的相关研究较少。本研究结果显示，治疗后两组患者精子Fas mRNA和FasL mRNA表达水平低于治疗前(P<0.05),且治疗组Fas mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。治疗后两组精浆Fas蛋白表达水平低于治疗前(P<0.05),且治疗组Fas蛋白表达水平低于对照组(P<0.05)。

少精子症古文无此病名，属于“精少”“精稀”“精薄”等范畴。《素问·上古天真论》认为男性的生育能力取决于肾精的盛衰，肾为先天之本，若肾精不足，脉络空虚，则生精乏源，精子不得充养，故肾精亏虚是男性不育的基础；肝功能与肾功能密切相关，肝藏血、肾藏精，精能生血，血能化精，若肝血不足，也可引起肾精亏损；此外，脾主运化为气血、生化之源，为后天之本[15]。中医总体上认为该病的发病部位主要是在肾，亦与肝、脾关系密切，临床上多从肾、肝、脾着手来辨证论治，填精补肾法是治疗男性少精子症的主要方法。桂药生精胶囊由菟丝子、覆盆子、淫羊藿、车前子、党参、金樱子、天冬、红参、黄芪、麦冬、桑椹子、女贞子、枸杞子、红花、甘草组成，诸药合用，共奏滋阴补肾、温肾壮阳、健脾养肝、养血通脉之功，适用于精液清稀、腰膝酸软、神疲肢倦、性功能减退、脉细等肾精亏虚型少精子症患者。将桂药生精胶囊进行网络药理学分析，其有效成分主要是黄酮类、多糖类、微量元素等。黄酮类化学成分可调节机体的内分泌，改善睾丸生精小管结构，促进支持细胞的增殖分化，促进精子产生，减少生殖细胞凋亡，恢复性功能和生育力，其机制可能与黄酮类化学成分能抗氧化活性有关[16,17,18,19];多糖类化学成份能抑菌、抗炎症、改善睾丸微环境、提高机体免疫力和精子质量等[20];微量元素锌等可调节精子的生成和活力，并能有效控制前列腺炎等[21]。本课题组在前期的基础研究中发现，桂药生精胶囊可干预精子相关细胞凋亡，改善睾丸生精微环境，提高大鼠精子质量，该方法从多渠道、多靶点、多种机制共同作用治疗少精子症[14]。

本研究对照组口服左卡尼汀，该药主要在抗氧化和改善细胞能量代谢方面发挥作用，能有效提高精子数量和活力，作为男性少精子症基础治疗的推荐药物[22];治疗组在此基础上服用桂药生精胶囊。结果显示，治疗后，两组患者精子SC、PR、PR+NP和精子总数均比治疗前升高(P<0.05),且治疗组患者精子SC、PR和精子总数均高于对照组(P<0.05)。分析与桂药生精胶囊的有效成分包括黄酮类、多糖类、微量元素等有关；本研究结果显示，治疗后两组患者精子Fas mRNA和FasL mRNA表达水平低于治疗前(P<0.05),且治疗组Fas mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。治疗后两组精浆Fas蛋白表达水平低于治疗前(P<0.05),且治疗组Fas蛋白表达水平低于对照组(P<0.05)。分析与左卡尼汀和桂药生精胶囊的抗氧化活性相关，精子的抗氧化能力越强，凋亡就越少；治疗组精子Fas mRNA及精浆Fas蛋白的表达水平较对照组低，与桂药生精胶囊经生物通路富集分析得到的对细胞凋亡信号通路的抑制作用有关。

本研究结果显示，桂药生精胶囊能显著提高少精子症(肾精亏虚型)患者精液常规参数SC、PR和精子总数，能显著降低精子Fas mRNA及精浆Fas蛋白表达水平。因此认为桂药生精胶囊治疗少精子症可能是通过抑制细胞凋亡通路，下调精子Fas mRNA及精浆Fas蛋白的表达水平来实现的。由于本研究纳入的样本量较少，有一定的局限性，并且只是对桂药生精胶囊治疗少精子症的机制做了初探，希望在以后的研究中纳入更多的样本和研究更多与精子凋亡相关的指标，对其作用机制做进一步的探讨。

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基金资助:广西壮族自治区中医药管理局科研课题(gzzc2019112);

文章来源:戴芳,唐亚平,买鹏宇,等.基于fAS/fASl信号通路对桂药生精胶囊治疗少精子症的临床研究[j].检验医学与临床,2024,21(11):1543-1547.