肝脏是负责外源性代谢最重要的器官，是调节物质生物转化的敏感靶点[1]。然而，在生物转化为低毒物质的过程中通过产生活性氧、形成活性代谢物和激活调节细胞死亡或存活信号转导通路等途径可能产生诱导肝脏损伤的分子[2]。许多外源物如药物和环境化学物等能够引起一定程度的肝损伤[3]。随着生活方式的改变，肝损伤已成为世界上最常见的疾病之一，其发病率和死亡率都很高，尤其是在发展中国家[4]。中药作为治疗或预防外源性肝损伤的潜在药物，因其多靶点作用、低毒及不良反应少等优势受到越来越多的关注。

独活Angelicae Pubescentis Radix被收载于《中国药典》2020年版，为伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，具有祛风除湿、通痹止痛之功效[5]，其作为一种常用的抗风湿镇痛药在我国用于治疗风湿病的关节痛和头痛已有近2 000年的历史。现代药理学研究表明，独活提取物具有神经保护、抗肿瘤、抗关节炎、抗炎和镇痛等作用[6]。独活中含有的香豆素类化合物紫花前胡苷对脂多糖所致小鼠肝损伤显示出优于水飞蓟素的保护作用[7]，但是独活对化学性肝损伤的保护作用尚不明确，本研究通过建立四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导的小鼠急性肝损伤模型，探讨独活对急性肝损伤的保肝作用和作用机制，为临床上治疗外源性肝损伤提供实验基础和理论依据。

1、材料

1.1动物

SPF级雄性昆明小鼠，8周龄，购自重庆恩斯维尔生物科技有限公司，生产许可证号SCXK（湘）2019-0004，饲养于西南大学药学院动物实验中心，在恒温21～23℃、恒湿60%～70%,12 h昼夜交替的环境下饲养，给予普通饲料，自由进食饮水。动物实验经西南大学动物实验伦理委员会批准（批准号IACUC-20201210-03），所有程序均严格按照动物使用和护理的伦理原则进行。

1.2药材

独活药材于2019年3月采于重庆市巫山县官阳镇，经西南大学药学院袁吕江教授鉴定为伞形科植物重齿毛当归A.pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，标本（20190302）存放于西南大学药学院。

1.3药品与试剂

丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）测定试剂盒（批号ml095162）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）测定试剂盒（批号ml095194）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）测定试剂盒（批号ml095262）、过氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）测定试剂盒（批号ml092620）、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）测定试剂盒（批号ml002095）、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6）测定试剂盒（批号ml098430）、IL-1β测定试剂盒（批号ml098416）均购自上海酶联股份有限公司；磷酸化κB抑制蛋白激酶（phosphorylated kappa B inhibitor protein kinase,p-IKK）抗体（批号ab302958）、核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor,Nrf2）抗体（批号ab62352）、血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1,HO-1）抗体（批号ab305290）来自上海艾博抗贸易有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗体（批号60004-1-Ig）、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4）抗体（批号66350-1-Ig）、髓分化因子88 (myeloid differentiation factor 88,My D88）抗体（批号67969-1-Ig）、磷酸化IκB-α抑制蛋白（phosphorylated kappa B alpha kinase,p-IκBα）抗体（批号51066-1-AP）、磷酸化核因子-κB p65(phosphorylated nuclear factor-κB p65,p-p65）抗体（批号82335-1-RR）、TNF-α抗体（批号60291-1-Ig）、山羊抗兔Ig G二抗（批号PR30011）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；蛇床子素对照品（批号JOT-10359，质量分数≥98.0%）、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号JOT-10327，质量分数≥98.0%）均购自成都普菲德生物有限公司；水飞蓟宾（批号S81788）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；其他试剂为分析纯。

1.4仪器

AL104型电子天平（梅特勒托利有限公司）；synergy H1型酶标仪（基因有限公司）；164-5070型通用电泳仪（美国Bio-Rad公司）；SCIENTZ-207A型全自动匀浆机（新芝生物科技有限公司）；LC-20A型岛津高效液相色谱仪（日本岛津仪器有限公司）；CX41RF型光学显微镜（日本Nikon公司）；GTR116C型高速离心机（湖南可成仪器设备有限公司）。

2、方法

2.1独活醇提物的制备

将独活药材粉碎为粗粉，取独活粉末1.0 kg，加10倍量75%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并醇提液，回收溶剂至无醇味并冷冻干燥，得到独活醇提物。

2.2分组、造模与给药

小鼠适应性饲养1周后，随机分成对照组、模型组及独活醇提物低、中、高剂量（50、150、300mg/kg）组和水飞蓟宾（63 mg/kg）组，每组10只。依据《中国药典》2020年版中独活剂量（3～9 g）与实验动物与人的体表面积换算关系进行剂量换算。各给药组ig相应药物，对照组和模型组ig等体积0.5%羧甲基纤维素钠，1次/d，连续给药1周。末次给药2 h后，除对照组外，其他小鼠ip 0.2%CCl4溶液，禁食不禁水24 h，眼眶静脉丛取血，收集血清和肝脏组织。

2.3血清生化指标检测

全血室温静置2 h后，3 000 r/min离心15 min，分离血清，按照试剂盒说明书检测血清中ALT、AST、SOD活力和GSH含量。

2.4肝脏中炎症指标检测

称取适量的肝组织，加入冰冷的生理盐水作为匀浆介质，在冰浴中制成10%肝组织匀浆液，3 000r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

2.5肝组织病理学观察

取固定于福尔马林的部分小鼠肝脏最大叶中央区域肝脏，进行石蜡包埋、切片、常规苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，然后将切片置于光学显微镜下观察肝组织病理变化。

2.6 Western blotting检测肝组织中Nrf2/HO-1和TLR4/My D88/NF-κB信号通路相关蛋白表达

肝脏组织采用蛋白提取试剂盒提取蛋白样本，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h后，分别加入以1∶8 000稀释的一抗，以GADPH作为内参，4℃孵育过夜。洗膜，将膜浸入以1∶10 000稀释的二抗稀释液中，室温孵育2 h。用TBST洗去过量的二抗后，进行曝光、显影，并用Image J软件进行条带的定量分析。

2.7统计学分析

实验结果以表示，采用Graphpad Prism 8.0软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组内两两比较采用学生t检验（student t test）。

3、结果

3.1独活及其提取物的质量控制

《中国药典》2020年版[5]规定独活含蛇床子素（C15H16O3）不得少于0.50%，含二氢欧山芹醇当归酸酯（C19H20O5）不得少于0.080%。参照《中国药典》2020年版方法对本研究所用独活进行含量测定，测得蛇床子素质量分数为1.48%，二氢欧山芹醇当归酸酯质量分数为0.20%，符合《中国药典》2020年版标准（图1）。本研究制备了独活醇提物用于小鼠体内药效研究，醇提物提取率为21%，独活醇提物中含蛇床子素12.69 mg/g、二氢欧山芹醇当归酸酯1.46 mg/g。

图1 混合对照品及独活的HPLC图谱

3.2独活醇提物对急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、SOD活性及GSH水平的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST活性显著升高（P<0.001），表明CCl4可引起小鼠肝脏转氨酶活性升高，显示出肝脏毒性。与模型组比较，各给药组小鼠血清中ALT和AST活性均显著降低（P<0.01、0.001），表明独活醇提物对CCl4导致的小鼠肝损伤具有明显的保护作用。

与对照组比较，模型组小鼠血清中GSH水平和SOD活性明显降低（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中GSH水平和SOD活性均显著升高（P<0.01、0.001）。表明独活醇提物能够通过抗氧化应激改善CCl4导致的小鼠肝损伤。

3.3独活醇提物对急性肝损伤小鼠肝组织中炎症因子水平的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高（P<0.001），表明在肝损伤小鼠中产生了严重的肝脏炎症。与模型组比较，各给药组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著下降（P<0.01、0.001），表明独活醇提物能够改善急性肝损伤小鼠的肝脏炎症。

图2 独活醇提物对急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST、SOD活性及GSH水平的影响

与对照组比较：#P<0.05##P<0.01###P<0.001；与模型组比较：*P<0.05**P<0.01***P<0.001，下图同。

图3 独活醇提物对急性肝损伤小鼠肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影响

3.4独活醇提物对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响

如图4所示，对照组小鼠肝细胞排列整齐，结构完整；模型组小鼠肝组织出现明显的细胞坏死、中央静脉充血、炎性细胞浸润等病变；各给药组小鼠肝细胞坏死、瘀血状况及炎性细胞浸润均得到明显缓解，表明独活醇提物能够改善CCl4所致小鼠肝损伤。

图4 独活醇提物对急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响(HE,×200)

3.5独活醇提物对急性肝损伤小鼠肝组织中

Nrf2/HO-1和TLR4/My D88/NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

如图5-A所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，各给药组Nrf2和HO-1蛋白表达水平均显著升高（P<0.05、0.01）。如图5-B所示，与对照组比较，模型组小鼠肝组织中TLR4、My D88、p-IKK、p-IκBα、p-p65、TNF-α蛋白表达水平均显著升高（P<0.01、0.001）；与模型组比较，各给药组TLR4、My D88、p-IKK、p-IκBα、p-p65、TNF-α蛋白表达水平均显著降低（P<0.05、0.01、0.001）。

图5 独活醇提物对急性肝损伤小鼠肝组织中Nrf2/HO-1 (A)和TLR4/My D88/NF-κB信号通路(B)相关蛋白表达的影响

4、讨论

CCl4是一种能够产生化学性肝损伤的毒性化合物，当其进入机体后，途径肝脏时，肝脏中的肝微粒细胞色素P4502E1将CCl4分解为三氯甲基自由基和三氯甲基衍生物等一系列有害物质，最终可以导致肝细胞产生脂质过氧化和一系列炎症反应[8]。CCl4诱导的肝损伤是经典的实验性肝损伤动物模型，其机制和原理更类似于人类药物性急性肝损伤，可用于保肝药物的筛选、评价以及肝损伤的机制研究[9]。

在CCl4致肝损伤的过程中肝细胞膜受损，使其通透性增加，让原本在细胞内的大量物质释放到血液中，如代表性的活性物质ALT和AST在血液中的活性会显著升高，因此ALT和AST可作为评判肝损伤严重程度的重要指标[10]。独活中的香豆素类成分具有显著的抗炎、镇痛等作用[11-12]，但对独活是否具有保肝作用未有探讨。本研究表明，独活醇提物能显著降低CCl4诱导的急性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，并改善小鼠肝脏细胞坏死、内皮出血及炎性细胞浸润等病理状况。

氧化应激和炎症反应在介导急性肝损伤的发生和发展过程中具有至关重要的作用，抑制氧化应激和炎症被认为是治疗肝损伤的重要策略[13]。过度的氧化应激会导致内源性抗氧化剂的耗竭而引起肝损伤[14]。SOD和GSH是人体内主要清除自由基的抗氧化剂[15]，维持着机体的氧化还原平衡。氧自由基积累过多时肝脏受损，SOD活性和GSH含量越低，肝损伤程度越严重[16]。本研究结果显示，CCl4所致肝损伤小鼠血清中GSH水平和SOD活性显著降低，而不同剂量的独活醇提物能通过调节机体抗氧化系统使其趋于正常，缓解肝损伤。

Nrf2作为参与调节细胞抗氧化反应和氧化应激的转录因子，调控多种氧化还原平衡以及抗氧化蛋白的表达[17-18]。HO-1是Nrf2信号的下游蛋白，能够通过降解亚铁血红素生成一氧化氮等产物参与氧化应激损伤等病理生理过程[19]，对抑制氧化应激和维持细胞稳定状态至关重要[19]。结果显示，模型组小鼠肝组织中Nrf2和HO-1蛋白表达显著高于对照组；与模型组比较，独活醇提物可提高Nrf2和下游蛋白HO-1的表达从而达到抗氧化的作用。

细胞膜受损裂解时，大量内容物释放出来，从而引发炎症反应[20]。IL-1β和TNF-α是重要的炎症因子，参与炎症反应、细胞凋亡、氧化应激等过程，具有强烈的促炎活性[21-23]。在TNF-α的刺激下白细胞不断加剧炎症反应[24]，吞噬细胞产生IL-6，诱导趋化、胞吐和爆发，加剧促炎因子表达[25]。在本研究中，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显升高，而独活醇提物明显抑制了炎症因子的产生，从而缓解炎症反应。

TLR4/My D88/NF-κB信号通路主要介导炎症因子反应，与肝损伤密切相关[26]。当机体受到外界刺激时，首先触发先天免疫，诱导TLR4表达，一些内源性配体通过激活TLR4受体，使TLR4表达增高，与My D88进一步结合后，诱导NF-κB p65从细胞质转移到细胞核，从而导致TNF-α、IL-1β等促炎因子的释放[27]，产生适应性免疫反应，初始炎症信号持续放大，从而产生所谓的炎症瀑布效应[28-29]。当炎症发生时，IκB激酶蛋白的IKK磷酸化促进其降解，并与NF-κB解离，NF-κB游离后易位到细胞核诱导炎症因子的转录和翻译[30]。本研究中，独活醇提物显著抑制TLR4、My D88、TNF-α、p-IKK、p-IκBα、p-p65的蛋白表达，表明独活醇提物可以激活TLR4/My D88/NF-κB信号通路，通过调节下游细胞因子缓解CCl4引起的急性肝损伤，减轻炎症细胞浸润，从而使肝损伤得到明显改善。且独活醇提物的疗效与阳性对照药水飞蓟宾并无明显差异。

综上，独活醇提物对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路抗氧化损伤，同时调控TLR4/My D88/NF-κB信号通路减轻炎症反应，发挥其保肝作用。本研究为进一步探索独活保肝作用及拓展其临床应用提供了一定的实验依据。

参考文献:

[8]徐彭,谈伟锋,刘波,等.四氯化碳诱导的小鼠肝损伤模型比较[J].江西中医药大学学报, 2014, 26(3):66-69.

[13]唐浪,宋添力,吴广阳,等.土家药竹节参多糖通过Nrf2-ARE信号通路对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的抗氧化保护作用[J].中草药, 2023, 54(15):4866-4873.

基金资助:重庆市中医药重点建设学科(2021-4322190044);

文章来源:吴诗慧,龙潇云,赵邯涛,等.独活醇提物对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及机制[J].中草药,2024,55(17):5867-5874.