膝骨关节炎(KneeOsteoarthritis,KOA)早期以膝关节周围弹响、疼痛,晚期以膝关节内外翻畸形和严重屈伸旋转功能障碍为特征[1-2]。蛇床子素(Osthole,OST)已被证明具有抗氧化、止痛功能,可调控软骨细胞的增殖、凋亡,可缓解软骨退变,对膝骨关节炎的治疗具有潜在作用[3]。蛇床子素可通过上调miR-9水平促进神经干细胞分化,起到保护神经系统的作用[4]。在膝骨关节炎患者中,miR-9表达明显降低,miR-9可通过靶向定位Protogenin(PRTG)基因调节软骨细胞的形态和细胞活性[5],PRTG过表达可激活p53/Caspase-3信号通路,促进小鼠软骨细胞凋亡[6],但蛇床子素如何发挥调控作用的机制尚需进一步研究,现报告如下。

1、材料和方法

1.1材料

获取膝骨关节炎患者膝关节置换术中废弃的软骨组织,所取患者软骨标本均得到患者及家属同意,并通过了医院的伦理审查。COL2A1、MMP13、miR9及PRTG检测试剂盒(苏州昂飞生物科技有限公司);蛇床子素(徐州医科大学药学院天然药物化学研究室)。

1.2方法

1.2.1软骨细胞提取及培养

收集本院骨科经临床诊断为膝骨关节炎患者关节置换术后废弃的无菌软骨标本,将获取的无菌软骨组织置入无血清DMEM培养基中,冰盒低温转移入超净台,置于无菌培养皿中,去除软骨周围的多余组织,用无血清DMEM培养液掩盖标本,将软骨组织剪切成1~3mm左右的碎块,分别用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶在37℃恒温摇床中消化30min和8h,软骨细胞大部分分离后过滤,收集滤液1000r/min离心5min,弃去上清,用PBS吹打浸洗2遍,加入含10%血清DMEM/F-12培养液制成细胞悬液,并移入培养瓶内,置于37℃恒温、5%CO2浓度、饱和湿度培养箱内培养软骨细胞。定期在显微镜下观察照相,记录软骨细胞生长形态和贴壁情况,用第3代软骨细胞进行实验。

1.2.2软骨细胞鉴定

形态学观察:通过倒置相差显微镜观察原代培养软骨细胞的形态学特征和生长增殖情况,并照相记录。甲苯胺蓝染色法:取第3代软骨细胞,于6孔板中的玻片上进行细胞爬片,待细胞贴壁后,去除培养液,取出玻片,用PBS清洗2遍;4%多聚甲醛固定1h,用1%甲苯胺蓝染色30min,染色后用双蒸水洗去多余染液;无水乙醇脱水,中性树胶封片,于倒置相差显微镜下观察并照相记录。

1.2.3细胞分组处理

取第3代软骨细胞进行实验,分为空白对照组和不同浓度蛇床子素处理组(0,10,50,100,150μmol/L),用含10%血清的DMEM/F-12培养液,置于37℃恒温、5%CO2浓度、饱和湿度培养箱内进行培养。

1.2.4CCK-8法检测细胞增殖

在96孔培养板中每孔接种100μL浓度为5×104个/mL的软骨细胞悬液,37℃培养箱孵育4~6h,空白对照组和不同浓度蛇床子素(0,10,50,100,150μmol/L)组各设6个复孔,观察细胞贴壁后加入不同浓度的蛇床子素处理软骨细胞,孵育24h后,每孔中加入10μL的细胞计数试剂(CCK-8),酶标仪上450nm波长处检测光密度(OD)值估计细胞活力。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡情况

收集处理后的第3代软骨细胞,并根据制造商的说明,用碘化丙啶(PI)和异硫氰酸荧光素偶联的AnnexinV进行染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡,并绘制散点图统计软骨细胞凋亡率。

1.2.6qRT-PCR检测

将对数生长期的各组细胞,采用Trizol法提取总RNA,采用PrimeScriptRTreagentKit(PerfectRealTime)试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。U6作为COL2A1、MMP13、miR-9、Caspase-3及PRTG的内参,用ABI7500实时定量PCR仪进行RTPCR实验,用OpticonMonitor3软件分析聚合酶链式反应(PCR)结果。引物检测结果见表1。

表1qRT-PCR引物序列

1.2.7WesternBlot法检测

在对数生长期的软骨细胞中加蛋白裂解液提取总蛋白,采用Bradford法(考马斯亮蓝法)进行蛋白定量。总蛋白(50μg)进行12%SDS-PAGE电泳后,将蛋白质转移至PVDF膜,与抗COL2A1、MMP13、miR-9、PRTG、Caspase-3及β-actin单克隆抗体,4℃下孵育过夜。用PBST洗膜3次,每次5min,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温下孵育2h,洗膜,配制化学发光液,以1∶1比例将鲁米诺试剂(LuminolReagent)和过氧化氢溶液(PeroxideSolution)(Millipore,美国)混匀,进行显色扫描拍照及分析,以目标条带与内参照条带的灰度值之比作为蛋白质的相对表达水平。

1.3统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用x±s形式表示,组间比较采用单因素方差分析,当方差不齐时采用布朗-福赛斯和韦尔奇方差分析,P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1软骨细胞形态学观察

软骨细胞大多数呈多边形(见图1a),甲苯胺蓝染色后软骨细胞核为蓝色(见图1b)。0,10,50,100μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞形态没有改变(见图1c)。在CCK-8实验中,当蛇床子素浓度超过100μmol/L时,细胞活力显著下降,而蛇床子素浓度≤100μmol/L对软骨细胞无毒(见图1d)。浓度为100μmol/L的蛇床子素对软骨细胞的保护作用最强(见图1d)。

图1软骨细胞形态学观察

2.2软骨细胞凋亡情况

不同组别软骨细胞凋亡情况如图2a~f所示。采用AnnexinV/PI检测各组软骨细胞的凋亡趋势(如图2a所示),空白对照组中软骨细胞凋亡率为14.60%±1.21%,而用0,10,50μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞对凋亡率(13.25%±1.32%)无影响。然而,随着100μmol/L蛇床子素的加入,软骨细胞凋亡率下降到5.67%±1.43%,与对照组及0,10,50μmol/L蛇床子素处理组比较差异有统计学意义(P<0.05),说明蛇床子素对软骨细胞凋亡具有抑制作用。而随着蛇床子素浓度的增高其抑制软骨细胞的凋亡作用随之降低,150μmol/L组的蛇床子素处理后的软骨细胞凋亡率为10.31%±1.16%,其与100μmol/L组蛇床子素比较软骨细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),且浓度为100μmol/L的蛇床子素抑制软骨细胞凋亡的作用最强。

图2不同组别软骨细胞凋亡情况

2.3qRT-PCR检测

COL2A1、MMP13、miR-9、Caspase-3及PRTG的mRNA表达情况用qRT-PCR检测COL2A1、MMP13、miR-9、Caspase-3及PRTG的mRNA表达情况,结果显示空白对照组中miR-9的表达下调,0,10,50μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞中miR-9表达未受影响。0,10,50,150μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞中COL2A1、MMP13、miR-9、Caspase-3及PRTG表达未受影响。100μmol/L蛇床子素组处理的软骨细胞中miR-9和COL2A1表达均上调,MMP13、PRTG及Caspase-3的表达下调。100μmol/L蛇床子素处理组与对照组、0μmol/L组、10μmol/L组、50μmol/L组及150μmol/L组比较差异有统计学意义(P<0.05),结果表明蛇床子素可通过上调miR-9抑制PRTG表达调节p53/Caspase-3通路,抑制软骨细胞凋亡和软骨基质降解,其中以蛇床子素100μmol/L组的作用最显著(见图3)。

图3qRT-PCR检测COL2A1、MMP13、miR-9、PRTG及Caspase-3的mRNA表达

2.4Western-Blot法检测

miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG及Caspase-3的蛋白表达情况图4为用WesternBlot法检测miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG及Caspase-3的蛋白表达情况,结果显示:与对照组比较,0,10,50,150μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞中miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG及Caspase-3的蛋白表达未受影响;100μmol/L蛇床子素处理的软骨细胞中miR-9和COL2A1蛋白表达上调,MMP13、PRTG及Caspase-3蛋白表达下调,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),结果表明100μmol/L蛇床子素可抑制软骨细胞凋亡和软骨基质降解。

图4Western-Blot法检测miR-9、COL2A1、MMP13、PRTG及Caspase-3的蛋白表达

3、讨论

膝骨关节炎的发病机制复杂,目前药物的治疗效果并不理想。中医药治疗膝骨关节炎的成本低,效果好,但中药中有效提取物的治疗效果仍值得深入研究[7]。蛇床子素是独活的主要活性成分,可抑制软骨细胞凋亡,但其作用机制尚不明确。笔者的前期研究[8]显示,小剂量的独活挥发油关节腔内注射可显著减轻兔膝骨关节炎,抑制软骨细胞的破坏,对软骨组织具有明显保护作用。为进一步探讨独活治疗膝骨关节炎的具体机制,本实验将独活主要药理活性成分蛇床子素进行提取后,研究其对膝骨关节炎软骨细胞退变的影响,并采用不同浓度蛇床子素进行干预,观察软骨细胞增殖、凋亡和软骨标志物生成及降解情况,分析miR-9及其靶基因PRTG表达调节p53/Caspase-3通路相关因子表达水平,验证miR-9与PRTG的靶向调节关系,分析蛇床子素对膝骨关节炎的作用机制,为临床治疗膝骨关节炎提供新的靶点及药物。本研究中体外软骨细胞培养实验表明,蛇床子素可通过上调miR9表达靶向调节PRTG基因,抑制p53/Caspase-3通路相关因子表达,进而抑制软骨细胞凋亡和软骨基质降解。

MicroRNAs(miRNAs或miRs)能够调节多种生理功能和疾病过程的基因表达,miRNAs通过控制靶基因,在调节关节炎的主要危险因素的作用中发挥了关键作用。调控基因的功能几乎涉及细胞过程的所有方面,包括增殖、分化、衰老和凋亡。软骨细胞是细胞外基质合成和周转的主要因素,在很大程度上影响关节炎的组织功能。既往研究证实miR-9、miR-27、miR140和miR-146等miRNAs在骨关节炎患者中异常表达,在骨关节炎的发生发展中发挥显著作用。Li等[9]研究认为miR-103在关节炎患者和模型大鼠的软骨组织中显著下调PI3K/AKT通路,降低SPHK1活性来促进关节炎的进展。在体外IL-1β诱导的关节炎模型中,MiR-146a的表达明显升高,抑制TGF-β信号通路,促进关节炎的发病机制[10]。miR-9参与了多种肿瘤的进展,可以靶向作用于PAK4,抑制结肠癌细胞的凋亡,还可靶向作用于SOCS5调控宫颈癌细胞的血管生成[11-12]。Chen等[6]研究认为miR-9可以抑制软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖。张彦秋等[13]研究认为miR-9过表达可能通过靶向下调PRTG的表达抑制膝骨关节炎软骨细胞的凋亡,这与本研究结果相似。然而有研究[14]表明miR-9在关节炎患者的软骨组织中高表达,并逆转MEG3对软骨细胞的保护作用,提示miR-9在关节炎进展过程中是一个损伤因子。膝骨关节炎发展过程中伴随着软骨基质的降解,其中MMP13被认为是最重要的基质金属蛋白酶之一[15]。在本研究中蛇床子素显著降低了MMP13的蛋白表达水平,同时上调了COL2A1的表达,因此可以推测蛇床子素可以保护软骨基质免于降解。

流式细胞术检测不同浓度蛇床子素处理后的软骨细胞凋亡率情况显示,浓度为100μmol/L蛇床子素处理组与空白对照组及0,10,50μmol/L蛇床子素处理组比较差异有统计学意义,说明蛇床子素对软骨细胞凋亡有抑制作用。而随着蛇床子素浓度的增高其抑制软骨细胞的凋亡作用随之降低,150μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞凋亡率为10.31%±1.16%,其与100μmol/L蛇床子素处理组比较软骨细胞凋亡率差异有统计学意义,且浓度为100μmol/L蛇床子素抑制软骨细胞凋亡的作用最强。qRT-PCR结果显示空白对照组中miR-9的表达下调,0,10,50μmol/L蛇床子素处理后的软骨细胞中miR-9表达未受影响,100μmol/L蛇床子素处理组中骨关节炎软骨细胞中miR-9的表达显著上调,150μmol/L蛇床子素处理组中骨关节炎软骨细胞中miR-9的表达降低。100μmol/L蛇床子素处理组与对照组、0μmol/L组、10μmol/L组、50μmol/L组及150μmol/L组比较,差异有统计学意义,表明蛇床子素可通过上调miR-9的表达来抑制软骨细胞的凋亡。这些研究与本研究的结论一致,充分证明了蛇床子素对软骨细胞凋亡的抑制作用。

为了阐明miR-9对下游分子的影响,本研究还分组比较了COL2A1、MMP13、PRTG及Caspase-3的表达。既往研究表明miR-9可调节MMP-13的分泌,而miR-9能够通过抑制IL-6的活性来抑制肿瘤的发生[16]。在膝骨关节炎患者中,miR-9表达明显降低,miR-9可通过靶向PRTG基因调节软骨细胞的形态和细胞活性[5],PRTG过表达可激活p53/Caspase-3信号通路,促进小鼠软骨细胞凋亡[6]。本研究中蛇床子素处理膝骨关节炎软骨细胞后显著增加了软骨细胞中miR-9和COL2A1的表达,同时MMP13、PRTG及Caspase-3的表达下调,进一步验证了蛇床子素对miR-9抑制PRTG表达、调节p53/Caspase-3通路的调控机制及其对膝骨关节炎发生发展的治疗作用。由此,笔者推测蛇床子素可能通过上调miR-9抑制PRTG表达,调节p53/Caspase-3通路,调控膝骨关节炎发生发展。另外,通过不同浓度蛇床子素处理体外软骨细胞,测试得出蛇床子素的最大有效和安全剂量,结果显示两者的范围一致,因此今后临床治疗应严格控制其有效及安全剂量。

综上所述,本研究进一步证实了蛇床子素可能通过上调miR-9抑制PRTG表达、调节p53/Caspase-3通路调控膝骨关节炎发生发展,抑制膝骨关节炎软骨细胞的凋亡及软骨基质的降解,从而保护关节软骨。但是,本研究也有一些局限性,本研究中软骨细胞实验仅来自同一供体,应该尝试来自不同供体的软骨细胞。此外,建立敲除特定基因(如miR-9)的动物模型也是下一步的研究重点,笔者后期将通过动物实验进一步验证这一结论。

基金资助:上海健康医学院附属崇明医院院级课题(CMYY2023-05);

文章来源:李业成,张巍.蛇床子素对膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2025,33(07):12-17.