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补阳还五汤对失神经肌萎缩大鼠自噬调控作用的实验研究

2024-09-10 60 上传者：管理员

摘要：目的:探究补阳还五汤对失神经肌萎缩大鼠自噬的调控作用，阐明益气活血法对失神经肌萎缩的保护机制。方法:制备神经夹伤大鼠模型，实验分假手术组、模型组、弥可保组、补阳还五汤、补阳还五汤+LY294002,每组8只；各组大鼠每日灌胃给药，第18天取胫前肌计算湿重比并进行形态学观察，Western-blot检测胫前肌PI3K/PKB/mTOR(磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶/B/雷帕霉素靶蛋白)信号通路蛋白。结果:模型组大鼠胫前肌湿重比显著降低(P<0.05),而补阳还五汤组和弥可保组胫前肌湿重比显著提高(P<0.05),补阳还五汤+LY294002组胫前肌湿重比下降。形态学观察发现：模型组肌纤维横截面积减少，形态不规则，肌纤维结构紊乱，结缔组织增生较多，肌纤维明显萎缩变性。补阳还五汤组胶原纤维增生明显减少(P<0.05),形态较规则。补阳还五汤+LY294002组肌萎缩加重，胶原纤维明显增多。补阳还五汤组、弥可保组p-PI3K、p-PKB、mTOR蛋白相对表达量与模型组相比显著增加(P<0.05)。Atg5, Becline-1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05);补阳还五汤+LY294002组p-PI3K、p-PKB、mTOR蛋白表达降低而Atg5, Becline-1蛋白表达升高。结论:益气活血法代表方——补阳还五汤可通过PI3K/PKB/mTOR通路抑制自噬-溶酶体系统过度激活，发挥失神经肌萎缩的保护作用。

关键词：
PI3K/PKB/mTOR信号通路
失神经肌萎缩
益气活血法
自噬-溶酶体系统
补阳还五汤
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骨骼肌是周围神经系统的靶器官，一旦失去神经支配，将不可避免地造成肌肉萎缩，目前临床上采用电刺激、被动运动等多种治疗方法尚不能取得满意疗效[1],因此防治失神经肌萎缩是临床亟待解决的难题；尽快寻找有效方法延缓失神经肌萎缩已经成为目前研究的热点。研究发现：益气活血法的代表方——补阳还五汤在形态和功能上对失神经肌萎缩都具有一定的防治作用[2]。

近来研究发现自噬-溶酶体系统是细胞内重要的蛋白质降解系统[3-4],适当活性的自噬降解系统能清除损伤组织提供机体能量，在维持骨骼肌质量中起重要作用；但是自噬溶酶体系统的过度激活可能会引起蛋白质过度分解而导致肌萎缩的发生。目前国内外尚未见关于神经损伤后肌萎缩自噬调控机制的报道。本文从自噬-溶酶体系统的新视角进一步深入研究失神经肌萎缩的发病机制；探讨补阳还五汤对失神经肌萎缩自噬-溶酶体系统的调节作用，为中医药防治失神经肌萎缩提供新的科学依据。

1、实验材料

1.1 实验药物

补阳还五汤(黄芪120 g、当归6 g、芍药6 g、地龙3 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g组成)煎煮、提取后浓缩成浸膏，每克含生药6 g, 南京中医药大学药学院制剂室制备。甲钴胺片(弥可保):卫材中国药业有限公司，批号：H20041642。LY294002:美国MCE公司，批号：HY-10108。

1.2 实验动物

选取SPF级SD大鼠40只，雄性，6 周龄，体质量(200±10)g, 由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。所有实验动物适应性饲养1 周后开始正式实验。

1.3 主要实验试剂与仪器

兔多克隆Atg5 抗体：武汉三鹰，AG0214;山羊抗兔 HRP 二抗：英国 Abcam, ab6721;山羊抗小鼠 HRP 二抗：英国 Abcam, ab6789;兔抗鼠mTOR多克隆抗体：Cat. Ab2732; 兔抗鼠p-PI3K多克隆抗体：Cat. ab182651;兔抗鼠p-PKB多克隆抗体：Cat. Ab38513; Masson 三色染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，G1340。

Mini Protean 3SDS-PAGE 电泳仪：美国 Bio-Rad; 170-3930湿法转膜仪：美国 Bio-Rad; 5200化学发光检测系统：上海 Tanon; GDS8000凝胶扫描系统：UVP,美国；GB303 千分之一电子天平：Mettler-Toledo Instr. Ltd; JEM-210透射电子显微镜：日本电子株式会社；RM2235石蜡切片机：上海徕卡仪器有限公司；BX51光学倒置显微镜：日本奥林巴斯。

2、实验方法

2.1 模型制备及分组给药

动物称重后麻醉，左股部手术区域常规备皮、消毒、铺巾。取左股后正中行1.5 cm切口，依次切开皮肤和筋膜，暴露坐骨神经股部后以14 cm止血钳向下行腓总神经钳夹术，上全齿钳夹3 次，每次钳夹10 s后间隔10 s, 挤压损伤的宽度为5 mm[2]。损伤远端以缝合线作标记后逐层缝合。模型由同一人同手法操作以减少实验误差，保证损伤程度的一致。40 只大鼠随机分为：假手术组、模型组、弥可保对照组、补阳还五汤组、补阳还五汤+LY294002(抑制剂) 组，每组8只。假手术组不进行腓总神经钳夹术，其余各组大鼠行腓总神经钳夹术成模后第2天开始灌胃给药；大鼠补阳还五汤每日给药剂量为25.92 g生药/kg(相当于成人剂量2倍),弥可保每日给药剂量为625 ng/g, 假手术组与模型组等量生理盐水灌胃，终浓度30 μmol/L的LY294002每天肌注1 mL;连续18 d。

2.2 观察指标

2.2.1 胫前肌湿重比及胫前肌形态学观察

造模后18 d取各组大鼠双侧胫前肌，电子天平称重。湿重比=手术侧胫前肌重量/非手术侧胫前肌重量。称重后固定、脱水、石蜡包埋、切片，肌肉Masson三色染色法染色，每个标本取8个切面，每切面随机取8个高倍镜视野，采用 Leica QWin 软件分析胫前肌横截面积与胶原纤维增生情况。

2.2.2 Western blot检测胫前肌自噬相关蛋白表达

灌制蛋白质聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE),将蛋白进行蛋白定量后上样电泳，电泳后湿转负极板上，200 m A恒流转膜1 h, 然后5%脱脂奶粉封闭1 h, 洗膜3次，一抗按1∶1 000比例稀释于5%脱脂奶粉中，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，二抗按1∶3 000比例稀释于TBST,室温孵育30 min, TBST洗膜3次，取出PVDF膜，ECL发光液显色，胶片扫描存Alpha软件处理系统分析目标带的灰度值。

2.3 统计学处理

计量资料用均数±标准差

表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验；以P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 各组大鼠胫前肌湿重比

模型组大鼠胫前肌湿重比显著降低(P<0.05):而补阳还五汤组和弥可保组湿重比显著提高(P<0.05),补阳还五汤+LY294002 组大鼠的胫前肌湿重比与弥可保组和补阳还五汤组比较有所下降。见表1。

表1 各组大鼠胫前肌湿重比比较

3.2 各组大鼠胫前肌形态学观察结果

肉眼：与假手术组比较，模型组肌肉形态明显萎缩变小，而弥可保组与补阳还五汤组肌肉萎缩明显改善，与模型组比较明显饱满。光镜：假手术组骨骼肌横切面可见肌纤维形态规则，横截面积较大，细胞结构排列整齐，细胞间隙较小，结缔组织少。模型组肌纤维横截面积明显减少，肌细胞大小不一，形态不规则，肌纤维结构紊乱，皱缩明显，细胞间隙明显增宽，结缔组织增生较多，与假手术组比较有显著性差异(P<0.05),肌纤维明显萎缩变性。与模型组比较，补阳还五汤组和弥可保组肌纤维轻度萎缩变性，胶原纤维增生明显减少(P<0.05),而且形态较规则，结构尚清晰、染色较均一，结缔组织增生不明显。补阳还五汤+LY294002组大鼠肌纤维萎缩程度较补阳还五汤组有所加深，组织间隙胶原纤维分布数量明显增多。见图1,表2。

3.3 各组大鼠胫前肌PI3K/PKB/mTOR自噬信号通路蛋白表达的Western blot检测结果

图1 各组大鼠胫前肌Masson 染色结果(Masson, ×200)

表2 各组大鼠胫前肌胶原纤维含量比较

与模型组相比，补阳还五汤组、弥可保组p-PI3K、p-PKB、mTOR蛋白相对表达量显著增加，具有显著性差异(P<0.05),Atg5, Becline-1蛋白相对表达量显著降低；补阳还五汤+LY294002组p-PI3K、p-PKB、mTOR蛋白表达降低而Atg5, Becline-1蛋白表达升高，逆转了补阳还五汤的作用。见图2。

4、讨论

失神经肌萎缩应归属于中医学“痿证”范畴。周围神经损伤后首先出现局部气滞血瘀，经络气血运行障碍，继而引起远端靶肌逐渐痿弱无力而导致失神经肌萎缩。气为血之帅，能推动血液正常循行；气虚则行血无力，逐渐形成瘀血；这种气虚血瘀的病理状态互为因果形成恶性循环，加重神经损伤后的肌肉萎缩；气虚为本，血瘀为标，气虚血瘀是失神经肌萎缩发病的主要病理机制；因此，益气活血法是防治失神经肌萎缩的重要法则。本实验结果表明，益气活血法的代表方——补阳还五汤可显著提升失神经胫前肌湿重比，减少结缔组织增生，明显改善胫前肌萎缩。近年来研究发现自噬-溶酶体系统是真核细胞内重要的蛋白降解系统。细胞通过自噬降解受损细胞，产生新的能量来循环利用。近年自噬异常与肌萎缩的相关性成为研究热点。多项研究证实：在多种疾病导致的萎缩骨骼肌中，都存在自噬相关基因的转录与信号转导通路的过度激活；抑制自噬可有效改善骨骼肌萎缩的发生[5-6]。然而失神经肌萎缩与自噬的相关性尚未见没有相关研究。

图2 各组大鼠胫前肌PI3K/PKB/mTOR自噬信号通路蛋白表达的Western blot检测结果及比较

Atg5与 Atg12形成复合物后参与自噻体的形成，Atg5与自噬泡膜结合还可促进LC3向自噬泡的募集，当形成闭环的双层膜结构的自噬泡时，Atg5复合物就从膜上脱离下来，留下与膜结合形式的 LC3-Ⅱ定位于细胞自噬体膜上；因此Atg5复合物对自噬体的形成至关重要。Beclin-1也是参与自噬过程的重要分子，为自噬反应的标志性基因。实验结果表明：模型组自噬相关基因Atg5、Beclin-1蛋白表达显著升高，说明失神经胫前肌中出现自噬，可能是神经损伤后肌肉萎缩的重要原因。补阳还五汤显著降低失神经胫前肌自噬相关基因Atg5、Beclin-1蛋白表达水平，减少胶原纤维的生成，提高其湿重比；而LY294002(PI3K抑制剂)却能阻断补阳还五汤的保护作用。说明补阳还五汤可能通过调节PI3K/PKB/mTOR信号通路抑制自噬过度激活，发挥失神经肌萎缩的保护作用。由此推测：益气活血法是通过益气生血与活血化瘀逐步恢复靶肌气血供应，改善气虚血瘀的病理状态，并通过PI3K/PKB/mTOR通路抑制自噬溶酶体系统过度激活，发挥失神经肌萎缩的保护作用，为中医益气活血法在失神经肌萎缩治疗中的进一步应用提供了新的科学依据

参考文献:

[1]谢清华.补阳还五汤对股骨粗隆间骨折术后患者的影响[J],光明中医,2023,38(11):2114-2117.

[5]许欣竹,段志园,董涵宇,等.益气健脾汤联合二甲双胍激活PI3K/Akt/mTOR通路调控自噬对抗糖尿病肌萎缩[J].世界科学技术-中医药现代化,2023,25(2):547-556.

[6]张宇洁,张敬各,张敏.C9orf72介导的自噬及其在肌萎缩侧索硬化与额颞叶痴呆中的作用[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2023,30(2):134-137.

基金资助:国家自然科学基金青年基金资助项目(81302890); 江苏省自然科学基金面上项目(BK20201399);

文章来源:周岚.补阳还五汤对失神经肌萎缩大鼠自噬调控作用的实验研究[J].中国中医药科技,2024,31(05):781-784.