创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder, PTSD)是一种由严重精神创伤事件引发的慢性精神障碍，目前治疗手段的效果有限[1]。有研究表明，抑制氧化应激和炎症反应能改善PTSD的发生和发展，如β-羟基丁酸通过抑制大脑神经炎症和氧化应激改善小鼠PTSD样行为[2]。髓系细胞触发受体-2(triggering receptor expressed on myeloid cells-2,TREM2)是一种仅存在中枢神经系统小胶质细胞上的免疫受体。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)提取自传统中药川芎，其具有抗炎、抗氧化损伤、抗细胞凋亡的作用，在治疗神经退行性疾病和抑郁症等精神疾病广泛使用[3]。本研究通过单次延长应激(single prolonged stress, SPS)建立PTSD小鼠模型，旨在探讨TMP对PTSD小鼠认知行为的影响及其作用机制，为PTSD的治疗提供新的思路和方法。

一、材料、对象与方法

1 材料

动物雄性C57BL/6J小鼠，鼠龄5周，体质量18～22 g, 购自安徽医科大学。动物生产许可证号：SCXK(皖)2022—001。本实验经皖南医学院第一附属医院伦理委员会批准(伦理批号：WNMC-AWE-2023407)。

药品与试剂川芎嗪，规格：每瓶50 mg, 纯度：99.87%,批号：39933,美国Med Chem Express公司生产。离子钙结合衔接分子-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1,Iba-1)抗体，英国Abcam公司生产；甘露糖受体(mannose receptor, CD206)抗体、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1β、IL-4和IL-10酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)检测试剂盒、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)细胞凋亡试剂盒和荧光二抗，均为碧云天生物技术有限公司生产。

仪器JP-2880全自动凝胶成像分析系统，上海金鹏分析仪器有限公司产品；VHX-X1光学显微镜，日本基恩士公司产品；MF52-N荧光显微镜，广州明美光电技术公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[4]

用SPS法建立C57小鼠PTSD模型。建模流程：束缚2 h、强迫游泳20 min、休息15 min后，用5%异氟烷麻醉，并给予足部电击(2 mA,2 s)。

2.2 动物分组与给药方法

将小鼠按随机数表法分为正常组、模型组和实验组。模型组和实验组按“2.1”的方法建立PTSD模型。实验组腹腔注射10 mg·kg-1TMP,正常组和模型组均腹腔注射等量0.9% NaCl,qd,连续给药2周。

2.3 Morris水迷宫实验、旷场实验、高架十字迷宫实验检测小鼠认知行为[5]

实验的前5 d为定位航行阶段，记录大鼠在90 s内找到平台的潜伏期，并让其在平台上停留30 s。若大鼠在90 s内未找到平台，则将其放置在安全平台上并停留30 s, 此时潜伏期记为90 s。将小鼠放入一个四周和底部均为黑色的立方体敞口箱内，并让小鼠朝向箱壁自由活动，记录小鼠在4 min内在中央区域停留的总时间。将小鼠放入高架迷宫，记录5 min内小鼠进入开放臂的次数和停留时间。

2.4 免疫荧光实验法检测海马CA1区细胞形态大脑皮质中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的相对表达水平[6]

制备大鼠脑组织切片样本，并立即用冰丙酮固定以防抗原弥散。用血清封闭减弱背景着色，并加入按比例稀释的一抗，4 ℃孵育过夜。磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤后，加入二抗室温避光孵育。4′6-二脒基-2-苯基吲哚(4′6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)复染细胞核后封片，最后在荧光显微镜下观察并采集图像。

2.5 TUNEL实验法检测细胞凋亡情况[7]

组织切片经PBS洗涤后，用4%多聚甲醛固定30 min, 再用PBS洗涤。随后加入含0.3% Triton X-100的PBS,室温孵育5 min, 用PBS洗涤2次。在样品中加入TUNEL检测液50 μL,37 ℃避光孵育60 min, PBS洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察。

2.6 ELISA法检测小鼠大脑皮质中的炎症因子含量[8]

制备小鼠大脑皮质织匀浆，按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪在450 nm波长处测量样本光密度值。

2.7 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)实验检测TREM2表达情况[9]

小鼠组织切片经过脱蜡和梯度乙醇水化处理，用PBS清洗2次。加入蛋白酶K,在37 ℃下孵育20 min。用等量的2×SSC在室温下漂洗切片3次。进行梯度乙醇脱水，在空气中干燥。切片滴加去离子甲酰胺，78 ℃下孵育8 min。再次进行梯度乙醇脱水，在空气中干燥。将切片置于湿盒中，与在73 ℃下用杂交缓冲液变性5 min的探针一起孵育，37 ℃过夜。去离子甲酰胺洗涤液洗涤切片15 min, 用2×SSC洗涤2次，再用PBS洗涤10 min。滴加DAPI工作液，在室温下避光孵育20 min, 用PBS洗涤2次。封片后在荧光显微镜下观察并拍照。

2.8 蛋白质印迹法检测氧化应激、炎症因子水平及炎症小体相关蛋白的表达水平[10]

细胞收集后，用PBS洗涤1次。加入RIPA裂解液将细胞重悬，并在冰上裂解30 min, 收集上清液。将变性后的蛋白质使用12%的预制胶进行电泳，并转移到PVDF膜上。在室温下用5%的去脂奶粉封闭膜1 h, 一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤膜5次，二抗在室温下孵育1 h。用TBST洗涤5次，在暗室中曝光。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 TMP对PTSD小鼠认知行为的改善与海马区神经细胞的影响

实验组腹腔注射TMP 10 mg·kg-1,正常组和模型组均腹腔注射等量0.9% NaCl。

正常组、模型组、实验组的逃避潜伏期时间分别为(56.50±9.89)、(87.16±10.48)和(68.63±10.19) s, 原平台游泳停留时间分别为(37.42±7.07)、(24.79±6.29)和(32.67±6.75) s, 旷场角落停留时间分别为(190.37±40.64)、(260.39±40.54)和(218.63±38.27) s, 行走总距离分别为(27.92±6.81)、(15.73±6.16)和(24.86±7.03) m, 闭合臂停留时间分别为(58.29±11.23)、(83.93±12.98)和(52.56±9.64) s, 进入开臂次数分别为(16.7±5.27)、(7.5±4.35)和(13.4±4.98)次。正常组和实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

模型组与正常组比较，海马CA1区细胞排列松散，间距增宽；实验组与模型组相比，细胞更为整齐，趋向正常，见图1。正常组、模型组、实验组的凋亡率分别为(18.28±2.35)%、(39.36±3.65)%和(30.74±3.58)%。模型组与正常组相比，CA1区的凋亡率显著增加(P<0.05);实验组与模型组相比，小鼠CA1区的凋亡率显著降低(P<0.05)。

图1各组小鼠海马CA1区细胞排列的免疫荧光检测(×200)

2 TMP对PTSD小鼠大脑皮质TREM2表达和小胶质细胞极化的影响

正常组、模型组和实验组的TREM2相对荧光强度分别为1.00±0.16、0.18±0.04和0.85±0.13,模型组与正常组相比，TREM2荧光强度显著减弱(P<0.05);实验组与模型组相比，TREM2荧光强度显著增强(P<0.05)。正常组、模型组、实验组的Iba-1荧光强度分别为(8.01±2.23)%、(50.87±7.31)%和(7.49±1.41)%,CD206荧光强度分别为(36.87±5.09)%、(5.54±0.69)%和(29.78±3.71)%。模型组与正常组相比，Iba-1荧光强度明显增强，CD206荧光强度明显减弱(均P<0.05);实验组与模型组相比，Iba-1荧光强度明显减弱，CD206荧光强度明显增强(均P<0.05)。

3 TMP对PTSD小鼠大脑皮质内氧化应激、炎症因子水平及炎症小体的影响

正常组、模型组和实验组的MDA分别为(5.46±0.95)、(12.98±2.06)和(8.31±1.28)nmol·mg-1,GSH-PX分别为(162.75±20.49)、(78.94±11.13)和(123.77±16.34)U·mg-1,SOD分别为(136.06±12.68)、(56.76±7.25)和(100.24±11.96)U·mg-1。正常组和实验组的上述指标与对模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。模型组与正常组相比，小鼠大脑皮质中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著升高(均P<0.01),IL-4和IL-10水平均显著降低(均P<0.05);实验组与模型组相比，小鼠的TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著降低，IL-4和IL-10水平均显著升高(P<0.05,P<0.01);模型组与正常组相比，NLRP3和Caspase-1的表达水平均显著升高(均P<0.001);实验组与模型组相比，NLRP3和Caspase-1的表达中平均显著降低(P<0.01,P<0.001)。结果见表1。

4 TMP对PTSD小鼠大脑皮质氧化应激的影响

如表2所示：模型组细胞与正常组相比，ROS荧光强度显著上升，核因子-E2相关因子2(neural regeneration factor 2,Nrf2)和血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)蛋白相对表达水平均显著降低(P<0.01,P<0.001);实验组与模型组相比，细胞ROS荧光强度显著下降，Nrf2、HO-1蛋白相对表达水平均显著升高(P<0.01,P<0.001)。

表1各组小鼠大脑皮质中炎性因子表达的比较

表2TMP对PTSD小鼠大脑皮质内活性氧(ROS)荧光水平和核因子-E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白相对表达的影响

三、讨论

PTSD是由创伤事件引起的精神疾病，会导致患者出现持续的恐惧、焦虑、抑郁等症状，目前尚无特效药物。TMP是一种中药成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等作用，被广泛用于治疗神经系统疾病。本研究结果发现，经TMP处理后，PTSD小鼠的逃避潜伏期显著下降，在原平台游泳停留时间显著上升，在旷场角落停留时间明显缩短，行走总距离明显增长，在闭合臂停留时间显著降低，进入开臂次数明显增加，凋亡率显著降低，表明TMP能够改善PTSD小鼠的认知功能、海马区神经细胞的形态结构，抑制凋亡。

TREM2能够抑制中枢炎症、提高吞噬细胞的吞噬能力，通过多种通路调控PTSD的发生和发展[11]。Iba-1是小胶质细胞M1极化标志物，其水平与小胶质细胞活化增生情况呈正相关[12]。CD206是小胶质细胞极化为M2表型后分泌的抗炎因子，能抑制炎症反应[13]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)和胱天蛋白酶-1(cysteine-requiring aspartate protease-1,Caspase-1)共同组成经典炎症信号途径，活化如IL-1β的炎性因子加重炎症反应。在小胶质细胞处于M1激活状态时，会释放炎症因子，使TNF-α、IL-6和IL-1β的水平升高，造成脑损伤。张冲等[14]研究发现，SPS诱发海马小胶质细胞介导的炎症，在PTSD小鼠中Iba-1表达上调。本研究结果发现，TMP能够逆转由PTSD引起的小鼠大脑皮质中TREM2和CD206表达下调，Iba-1、NLRP3、Caspase-1表达上调，这表明TMP可能通过促进TREM2的表达，促进PTSD小鼠大脑皮质中小胶质细胞的M2极化，抑制M1极化，进而改善认知功能。

ROS是含氧自由基和易形成自由基的过氧化物的总称；核因子-E2是细胞中的关键氧化还原敏感性转录因子，能够促进下游HO-1等因子的表达，维持氧化应激水平；GSH-PX、SOD是抗氧化物质；MDA是脂质过氧化物，当机体处于氧化应激状态时，ROS的水平会大幅提高，促进PTSD的发生和发展[15-16]。本研究结果发现，实验组小鼠大脑皮质中的促炎因子含量显著降低，抗炎因子含量显著升高；ROS、MDA水平均显著下降，GSH-PX、SOD、Nrf2和HO-1活性均显著上升，表明TMP能改善PTSD小鼠大脑皮质中的炎症、氧化应激水平。

本研究提示：TMP能改善PTSD小鼠的认知功能，其机制可能是促进TREM2的表达，抑制小胶质细胞M1极化，促进M2极化，改善小鼠大脑皮质中的炎症、氧化应激水平。

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基金资助:安徽省自然科学基金资助项目(2208085MC55); 皖南医学院校中青年科研基金资助项目(WK2021F12);

文章来源:郭玲,陈永权,刘灿,等.川芎嗪调控创伤后应激障碍小鼠认知功能的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(19):2880-2884.