多发性骨髓瘤(MM)是常见于中老年人群且目前尚无法治愈的血液系统非实体性恶性肿瘤，发病以65岁以上男性多见，随着人口老龄化的加剧，MM发病率逐年升高，目前MM是淋巴造血系统第二大恶性肿瘤，由于其具有高度临床异质性、复发性和难治性，MM死亡率居高不下[1]。然而，MM的发生、发展是由各种驱动基因参与的复杂调控过程，MM先由无症状且意义未明的单克隆丙种球蛋白病逐渐演变成冒烟型MM，随后逐渐发展为大量单克隆浆细胞(M蛋白)在骨髓中恶性增殖，最终导致多器官和功能终末期损害[2]。随着中医药领域研究的不断探索，传统中医药及其复方制剂的替代疗法已在恶性血液病中发挥了重要的作用，并在化疗增敏、逆转耐药以及减低化疗毒性等方面有较好的临床疗效[3-5]。化瘀解毒汤作为一种纯中药复方制剂，在胃癌、结肠癌、肺癌以及肝癌中已展现出显著的药理活性和良好的抗肿瘤效应[6-9]。然而，目前暂无研究发现并证实化瘀解毒汤是否在血液系统肿瘤领域具有相应的抗癌疗效及药理学作用，值得研究和探讨。

一、材料与方法

试剂与仪器

胎牛血清、RPMI 1640培养基均购自美国Gibco公司;青霉素-链霉素双抗、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物公司;TRIzol试剂购自上海Invitrogen公司;氯仿、异丙醇、无水乙醇均购自上海振兴化工公司;DEPC购自上海生工公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所;逆转录试剂盒购自南京诺唯赞公司;SYBR Green Master(ROX)购自北京康为世纪生物公司;化瘀解毒汤中药材购自赣南医科大学第一附属医院中药房;Bcl-2、Bax、GAPDH抗体均购自美国CST公司，survivin、Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)抗体购自美国Abcam公司;离心机、移液枪及微量加样器均购自德国Eppendorf公司;YJX40-G型密闭煎药机购自北京东华原医疗设备有限公司;旋转蒸发仪购自上海科兴仪器有限公司;ALPH2-4/LSC型冷冻干燥机购自广州倍立思仪器有限公司;超净台、酶标仪、二氧化碳细胞培养箱、超低温-80℃冰箱均购自美国Thermo Fisher公司;FACS流式细胞仪购自美国BD公司。

化瘀解毒汤水煎剂制备

本研究中的化瘀解毒汤主要成分包含桃仁10 g、生大黄5 g、当归20 g、赤芍15 g、玄参30 g、黄芪40 g、党参15 g、白术5 g、半夏5 g、三棱5 g、莪术10 g以及白花蛇舌草5 g共十二味中草药配伍组方而成，将各中药材组分碾碎，并放入容器中，加药材8倍量双蒸水浸泡1 h，煎煮提取3次，第1次2 h，第2次1h，第3次1 h，将煎煮液去渣取汁，合并浓缩制备成生药浓度为2 g/ml的浓缩液，置于-20℃保存备用。在进行干预细胞实验前，将浓缩液于室温下解冻，18 000×g离心10 min，取上清液用0.22μm滤膜过滤除菌后4℃避光保存，用RPMI 1640培养基稀释至所需工作液浓度，工作液p H值为7.2-7.4。

细胞株与细胞培养

人MM细胞株U266细胞由本院科研中心保藏提供。将U266细胞置于含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，并在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。细胞每2-3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

细胞活性增殖实验

取对数生长期U266细胞，制备成单细胞悬液并调整细胞密度至4×104/ml接种于96孔板，每孔体系100μl，其中细胞悬液90μl及10μl化瘀解毒汤，使其终浓度分别为2.5、5、10、20、40 mg/ml。各浓度组设3个复孔，同时设置对照组(不加药，加入DM-SO)及空白组(只含培养基而无细胞)，分别在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中分别培养24、48及72 h，按CCK-8试剂盒说明书加入CCK-8液并置于培养箱中孵育2 h后用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度(A450)值，实验重复3次，取均值。计算公式:细胞活力(%)=[(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%]。

Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期U266细胞，调整细胞浓度至1×105/孔接种于6孔板，给予5、10、20 mg/ml化瘀解毒汤干预细胞，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS清洗2次，弃上清，往管中加入400μl×Annexin V重悬细胞，再加入5μl的Annexin V-FITC染色液，4℃避光孵育20min，加入10μl PI染液，4℃避光孵育5 min，用BD FACSVerse流式细胞仪检测细胞凋亡率，用Flow Jo10.0软件进行数据分析。凋亡细胞=早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞。其中，(Annexin V/PI)-(PI)-为活细胞，(Annexin V/PI)+(PI)-为早期凋亡细胞，(Annexin V/PI)+(PI)+为晚期凋亡细胞。

Western blot法检测凋亡及相关通路蛋白表达

取对数生长期U266细胞给予5、10、20 mg/ml化瘀解毒汤干预，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS清洗细胞2次，弃上清，使用全细胞蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，并利用BSA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。使用等量蛋白质进行SDS-PAGE电泳，后将其转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，洗涤后二抗孵育1 h，使用ECL化学发光试剂盒处理PVDF膜，在成像系统下曝光成像。

RT-q PCR技术检测基因表达改变情况

取对数生长期U266细胞给予5、10、20 mg/ml化瘀解毒汤干预，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，收集细胞并离心，PBS清洗细胞2次，弃上清，利用TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA，检测浓度和纯度后按逆转录试剂盒说明书逆转录成c DNA，应用ABI 7500型荧光定量PCR仪和SYBR Green Master(ROX)试剂盒进行PCR扩增，以GAPDH为内参照，引物序列为:GAPDH正向引物为5’-CACCCACTCCTCCACCTTTGA-3’，反向引物为5’-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3’;HMGB1正向引物为5’-AGGATCCCAATGCACCCAAG-3’，反向引物为5’-CGCAACATCACCAATGGACAG-3’;CX-CR4正向引物为5’-CACTTCAGATAACTACACCG-3’，反向引物为5’-ATCCAGACGCCAACATAGAC-3’;IL-6正向引物为5’-CATTCTGTCTCGAGC-CCACC-3’，反向引物为5’-ACAACATCAGTC-CCAAGAAGGCAAC-3’。总反应体系20μl，包括:2μl c DNA,10μl SYBR Green(ROX)，上、下游引物各0.5μl,RNase-free dd H2O 7μl;反应条件为:第一阶段(预变性):50℃2 min、95℃10 min,1个循环;第二阶段:95℃15 s(变性)、60℃1 min(退火/延伸)，共40个循环;第三阶段(溶解曲线分析):95℃15 s、60℃1 min、95℃30 s、60℃15 s,1个循环;采用Ct值比较法予对结果进行分析，并对比HMGB1、CXCR4、IL-6 mRNA表达水平，即ΔCt=Ct值目的基因-Ct值GAPDH，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CTGADPH)实验组-(CT目的基因-CTGADPH)对照组。

统计学分析

各实验均重复3次，采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。本研究所有数据均以Mean±SD表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，用Graph Pad Prism 7软件进行制图。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

化瘀解毒汤对U266细胞增殖活性的影响

如图1所示，给予不同浓度化瘀解毒汤(2.5、5、10、20、40 mg/ml)干预U266细胞后，细胞增殖活性均受到抑制，且呈浓度依赖性与时间依赖性(r=-0.713,r=-0.827)。

化瘀解毒汤对U266细胞凋亡的影响

如图2所示，与对照组相比，给予5、10、20 mg/ml化瘀解毒汤干预U266细胞48 h时，其凋亡率高于对照组，并呈浓度依赖性(r=0.823)。

化瘀解毒汤对U266细胞凋亡蛋白表达的影响

如图3所示，与对照组相比，化瘀解毒汤干预U266细胞48 h后，促凋亡蛋白Bax表达上调，同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2、survivin的表达以促进细胞凋亡(均P<0.05)。

化瘀解毒汤对U266细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响

如图4所示，与对照组相比，化瘀解毒汤干预U266细胞后，可下调TLR4/NF-κB磷酸化水平继而诱发细胞程序性死亡。

化瘀解毒汤对U266细胞HMGB1、CXCR4与IL-6表达的影响

如图5所示，利用化瘀解毒汤干预U266细胞后，可显著降低HMGB1、IL-6 mRNA的表达，但对CXCR4mRNA的表达基本无影响。

三、讨论

MM是一种因单克隆恶性浆细胞无限增殖所致的血液肿瘤，临床表现多伴随乏力、骨痛、蛋白尿、贫血等非特异性症状[10]。随着现代医学的不断发展，硼替佐米或伊沙佐米等蛋白酶体抑制剂、沙利度胺或来那度胺等免疫调节剂的研发与应用，MM的临床治疗有了一定突破，MM患者的预后获得了一定改善，但MM仍无法治愈，患者饱受病痛折磨，最终还会面临死亡[11-12]。

中医学将MM归属于“骨瘤”、“骨蚀”、“骨痹”、“腰痛”等范畴，中医药在提高临床疗效、减轻化疗不良反应与毒副作用以及预防化疗耐药的同时能够改善MM患者机体免疫内环境，逐渐恢复造血功能，进而延长MM患者的生存期[13]。随着中医学的不断发展，中医药治疗MM逐渐受到学术界的关注[14-15]。如前所述，化瘀解毒汤已被证实在部分恶性肿瘤的临床治疗中取得了令人满意的效果，但其在恶性血液病的临床与基础研究中是否同样具有良好的效果仍未可知，此为本研究深入分析和探讨的核心要点之一。

本研究使用化瘀解毒汤体外干预U266细胞，结果显示，化瘀解毒汤可抑制U266细胞增殖活性，并促进细胞凋亡，上述抗癌效应呈现浓度及时间依赖性，流式凋亡检测技术亦证实了上述效应的存在。凋亡作为经典Ⅰ型程序性细胞死亡，它的启动常受多种凋亡蛋白的综合作用与调控，本研究结果表明，化瘀解毒汤干预U266细胞后，可通过上调Bax的表达，同时下调survivin、Bcl-2蛋白的表达以诱发细胞凋亡，证明化瘀解毒汤可通过Bcl-2家族蛋白等发挥程序性死亡调控作用。

TLR4/NF-κB通路是免疫调节、氧化应激以及启动内源性炎性反应关键且经典的信号通路[16-17]。研究证实，下调TLR4的表达可抑制NF-κB向核内转移，并调控免疫平衡，修复与遏制免疫机制紊乱所致的细胞损伤与恶性转化[18-19]。本研究结果显示，与对照组相比，化瘀解毒汤干预U266细胞后，可下调TLR4/NF-κB磷酸化水平，继而诱发细胞程序性死亡，表明化瘀解毒汤可抑制TLR4表达，减弱NF-κB核转移，靶向作用于TLR4/NF-κB信号通路，同时抑制该信号通路的激活，进而削弱MM的恶性生物学特性，并可能修复骨髓微环境紊乱，延缓MM的病情进展，从而缓解临床症状。

值得关注的是，IL-6是TLR4/NF-κB信号通路激活的产物之一[20]。TLR4作为炎性反应通路的上游因子，活化的TLR4将促进IL-6的释放，加重正常细胞的炎性损伤与恶性转化[21]。此外，HMGB1已被证实在血液肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞增殖分化、侵袭转移以及化疗抗性等，化疗药物可促进肿瘤细胞释放HMGB1，从而对抗凋亡，并通过增加自噬效应诱导肿瘤细胞发生耐药[22-24]。而TLR4作为HMGB1的关键受体之一，HMGB1通过结合TLR4参与炎症调控、血管生成、肿瘤发生发展以及转移等生物学过程[25-26]。化瘀解毒汤干预U266细胞后，IL-6与HMGB1的表达均显著减低，表明化瘀解毒汤不仅可拮抗经典TLR4/NF-κB信号通路的激活，亦可下调免疫介质的释放与表达，从而诱导MM细胞程序性死亡，促进机体正常免疫调控功能的恢复，但其间伴随的分子机制仍需深入的研究与探索。目前，趋化因子受体等小分泌型蛋白在血液系统恶性肿瘤中的作用被逐渐揭示，其中，CXCR4在MM的发生、发展中尤为关键[27-28]。本研究结果显示，化瘀解毒汤对CXCR4的表达基本无影响，间接说明化瘀解毒汤可能无法调节CXCR4等趋化因子受体家族核心成员的表达及其互作网络继以调控MM细胞的恶性生物学行为。

综上所述，化瘀解毒汤能抑制MM细胞增殖活性并诱发程序性死亡，其分子机制可能与调控各凋亡蛋白表达以及抑制TLR4/NF-κB通路激活并下调HMGB1、IL-6的表达有关。由于MM病因机制仍未完全阐明，复发、难治与化疗耐药是MM临床诊疗与患者预后的难题和挑战，为此，本课题组后续将深入探究化瘀解毒汤在逆转化疗耐药、改善MM临床并发症等方面是否亦存在作用，以期为中医药治疗恶性血液病提供新的思路和参考。

参考文献:

1严志民,刘彦权,黄走方,等.T细胞亚群与细胞因子水平变化在多发性骨髓瘤患者临床诊疗及预后评估中的价值.中国实验血液学杂志,2022,30(6):1791-1796.

3廖斌,张逸,陈霞,等.中药复方君子汤对白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.中国实验血液学杂志,2010,18(6):1479-1483.

4李玉鹏,张建国,方梓青,等.补肾养骨汤对人多发性骨髓瘤耐药细胞KM3/BTZ多药耐药性的影响.中国实验血液学杂志,2019,27(2):482-488.

5曹翊雄,罗泽宇,李君君,等.含扶正解毒汤药血清对白血病K562/A02耐药细胞的抑制作用及初步机制.中国实验血液学杂志,2016,24(4):1024-1028.

10刘莹,隋靖喆,朱丽华,等.IL-6通过STAT3/Notch信号通路调控多发性骨髓瘤耐药细胞株对硼替佐米的化疗敏感性.中国实验血液学杂志,2022,30(5):1474-1481.

11史玉叶,侯强,陶红,等.CXCR4在多发性骨髓瘤中对卡菲佐米疗效及预后的影响.中国实验血液学杂志,2022,30(2):455-460.

12徐小梦,康迪,朱新宇,等.基于IRAK4/ERK/p38信号通路雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响.中国实验血液学杂志,2022,30(1):175-182.

13中国医药教育协会血液学专业委员会,中国中西医结合学会血液学专业委员会骨髓瘤专家委员会.多发性骨髓瘤中西医结合诊疗专家共识(2019).中华医学杂志,2019,99(28):2169-2175.

基金资助:江西省中医药管理局科技计划项目(2023A0351,2022B072);

文章来源:李祚涛,李海亮,严志民,等.化瘀解毒汤抑制多发性骨髓瘤恶性生物学特性的作用机制[J].中国实验血液学杂志,2024,32(05):1438-1443.