高血压肾病是我国慢性肾病的常见类型之一。中医药具有多靶点调节，疗效好，药物不良反应小的优势[1]。研究发现，一些中药配伍可以通过预防肾纤维化、改善肾流变学、抗细胞凋亡和抗氧化，稳定血压来保护肾功能[2-5]。牛膝和白芍是镇肝熄风汤、清肝引经汤和壮筋养血汤等五十余首方剂中的常见药对配伍，临床治疗高血压的疗效显著，两药配伍，补肾柔肝，潜阳熄风[2-5]。本实验通过设计牛膝与白芍的不同配比，用N-硝基-L-精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester, hydrochloride,L-NAME)加灌附子汤建立肝阳上亢型高血压肾病模型，探讨牛膝白芍配伍对肝阳上亢型高血压肾损伤的保护作用的最佳配比及机制，为高血压肾病的治疗提供新的思路。

一、材料与方法

1 材料

动物KM雄性小鼠，鼠龄6周，体质量(22±2)g, 由齐齐哈尔医学院动物研究所提供。动物使用许可证号：SYXK(黑)2021-013。本实验经齐齐哈尔医学院动物保护伦理委员会批准(伦理批号：QMU-AECC-2020-38)。

药物与试剂附子，批号：D20221,产地：四川，购自齐齐哈尔市中医医院；牛膝配方颗粒，批号：1013141,产地：广东，白芍配方颗粒，批号：0129411,产地：广东，均购自广州一方制药有限公司，上述中药材经齐齐哈尔市中医医院申红强教授分别鉴定为附子、牛膝配方颗粒、白芍配方颗粒。L-NAME,规格：每瓶5 g, 批号：N5751,购自德国西格玛奥德里齐有限公司；尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase, SOD)检测试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；血清肌酸酐(serum creatinine, SCr)含量试剂盒，购自上海江莱生物科技有限公司；丙二醛(malonaldehyde, MDA)检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；核因子E2相关因子-2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax),均购自美国Proteintech公司。

仪器小鼠无创血压计，美国Kent Scientific公司产品；DM3000光学显微镜，德国Leica显微系统(上海)有限公司产品。

2 实验方法

2.1 溶液配制

取生药附子20 g, 倒入冷水中浸泡20 min, 以使药材吸足水分，便于有效成分充分溶解；然后加入水200 mL用大火煮沸30 min, 再转加水150 mL用小火慢煎20 min, 煎煮完成后，将获取的药液倒入坩埚蒸发浓缩至100 mL,制成0.2 g·mL-1附子药液。

用蒸馏水15 mL溶解不同比例牛膝和白芍中药配方颗粒(每2.5 g牛膝颗粒相当于饮片10 g, 每1.0 g白芍颗粒相当于饮片10 g),换算成生药饮片量制成不同比例、质量浓度相同为0.67 g·mL-1的牛膝-白芍溶液。

将L-NAME药粉溶解于小鼠饮用的蒸馏水中并充分搅拌，配制成质量浓度约为0.17 mg·mL-1的L-NAME溶液。

2.2 模型构建、动物分组与给药方法

将80只小鼠随机分为空白组、模型组和实验A、B、C、D、E、F组，每组10只。空白组给予饮用蒸馏水，模型组和6个实验组均灌胃给予56 mg·kg-1·d-1L-NAME溶液+14 mL·kg-1·d-1附子汤(质量浓度为0.2 g·mL-1),连续6周复制肝阳上亢型高血压肾病[6-7]。实验A、B、C、D、E、F组灌胃给予6.83 g·kg-1·d-1不同比例配伍的牛膝-白芍溶液，分别为5∶0(牛膝配方颗粒2.5 g)、4∶1(牛膝配方颗粒2.0 g和白芍配方颗粒0.2 g)、3∶2(牛膝配方颗粒1.5 g和白芍配方颗粒0.4 g)、2∶3(牛膝配方颗粒1.0 g和白芍配方颗粒0.6 g)、1∶4(牛膝配方颗粒0.5 g和白芍配方颗粒0.8 g)、0∶5(白芍配方颗粒1.0 g);空白组和模型组均灌胃给予等体积蒸馏水。各组小鼠在早晨8～10点时间段连续给药6周。

2.3 小鼠易激惹程度观察

小鼠易激惹程度按参照文献[8]的分级方法进行评价。1级：手指捉持颈部时出现惊跳记1分；2级：捉持颈部时欲咬人或咬人记2分；3级：提拿尾部时出现惊跳、咬人或与同笼小鼠频繁打斗记3分；无上述情况者为记0分。

2.4 小鼠血压测量及标本采集

记录实验小鼠的一般状态。用小鼠无创血压计测量收缩压(systolic blood pressure, SBP),连续测量5次，取平均值。实验结束后，麻醉小鼠并处死，腹主动脉取血并分离血清，置于-20 ℃冰箱保存，取部分肾组织处理后备用。

2.5 试剂盒检测SCr、BUN、SOD和MDA水平[9-10]

取部分血清和肾组织，用试剂盒分别检测SCr、BUN含量及肾组织中SOD活性和MDA含量。所有操作均按试剂盒说明书流程严格执行。

2.6 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和Masson染色法检测各组大鼠肾组织病理学变化情况[11-12]

肾组织常规石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡，分级乙醇再水合等操作后，严格按照HE染色及Masson染色试剂盒的操作说明书的步骤进行染色。在镜下观察，采集任意5个视野图像，检测小鼠肾组织形态变化及肾纤维化程度。

2.7 免疫组化法检测Nrf-2、HO-1、Bcl-2和Bax蛋白的相对表达水平

选择空白组、模型组和实验C、D组进行免疫组化实验，按文献[13]的方法进行操作，用Image J 1.51软件进行定量分析测量累积光密度(integrated optical density, IOD)值。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较用LSD法。

二、结果

1 各组小鼠易激惹程度的比较

实验A、B、C、D、E、F组分别给予6.83 g·kg-1·d-1的5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5比例配伍的牛膝-白芍溶液；空白组和模型组均给予等体积蒸馏水。

空白组小鼠一般状态良好。模型组小鼠一般状态较差，且活动减少，结膜充血，皮毛干。各实验组小鼠的一般状态较模型组小鼠有不同程度的改善。模型组与空白组相比，小鼠激惹程度明显升高(P<0.01);实验A、B、C、D、E、F组与模型组相比，小鼠激惹程度均有所改善(均P<0.05)。结果见表1。

2 各组小鼠SBP、SCr、BUN、SOD和MDA水平的比较

模型组与空白组比较，SBP、BUN、SCr和MDA水平均显著升高，SOD活性显著下降(P<0.05,P<0.01);实验C、D组与模型组比较，SBP、BUN、SCr和MDA水平均显著降低，SOD活性均显著升高(均P<0.01)。结果见表2。

表1各组小鼠易激惹程度的比较

表2各组大鼠收缩压(SBP)、血尿素氮(BUN)、血清肌酸酐(SCr)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平的比较

3 各组小鼠肾组织病理改变及纤维化情况

HE染色结果显示：空白组小鼠肾结构清晰，肾小球及肾小管形态规则，无病理变化；模型组小鼠肾小球体积增大、淤血、萎缩，肾小管管腔堵塞，上皮细胞水肿、坏死，肾间质有炎性细胞浸润。实验C、D组与模型组比较，肾小管上皮细胞肿胀或萎缩减少，上皮细胞水肿缓解，组织间隙肿胀及炎性浸润均减轻。结果见图1。

Masson染色结果显示：空白组小鼠未见纤维化改变；模型组可见胶原纤维呈絮状，系膜区纤维化增生及肾小管纤维化；经牛膝-白芍溶液干预后，实验C、D组的纤维化均有不同程度减轻。结果见图1。

4 各组小鼠肾组织Nrf-2、HO-1、Bcl-2和Bax蛋白相对表达水平的比较

模型组与空白组相比，小鼠肾组织的Bcl-2蛋白表达水平下降，Nrf-2、HO-1和Bax蛋白相对表达水平升高。实验C、D组与模型组比较，小鼠肾组织的Nrf-2、HO-1和Bcl-2蛋白相对表达水平均显著升高，Bax蛋白相对表达水平均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结果见表3。

图1牛膝和白芍对小鼠肾组织病理变化的影响(左：苏木精-伊红染色，×40;右：马松染色，×40)

表3各组小鼠肾组织中核因子E2相关因子-2(Nrf-2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平的比较[累积光密度(IOD)值，

三、讨论

牛膝疏通筋脉、滋养肝肾、引火下行、下血降气，具有抗高血脂、抗氧化、抗炎等特性，在治疗老年高血压的核心药物运用频率中排名第1,具有明确的降压效果且对靶器官具有保护作用。白芍滋养阴液，柔润熄风，具有抗炎、镇静、免疫抑制作用。本研究结果显示，用牛膝白芍配伍治疗后，能够显著降低模型组小鼠尾动脉血压，降低易激惹程度，同时，降低BUN、SCr水平，减轻肾组织形态学损伤和纤维化程度，提示牛膝白芍配伍可以改善高血压肾损伤。

氧化应激反应激活肾细胞内的炎症因子，损伤肾小球内皮细胞，引起内皮功能紊乱，促进肾病的发病。在正常情况下，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成和清除维持一种动态平衡，而当ROS清除少于生成时可产生自由基，自由基会攻击机体，导致氧化应激[14];当ROS过量生成引发脂质过氧化，生成脂质过氧化物。MDA是脂质过氧化并降解的终产物，可导致组织发生氧化损伤[15]。当机体发生强烈氧化应激时，SOD合成减少，MDA产生增加，MDA产生的速率超过SOD清除速率，进而损伤肾，影响肾功能。本研究结果显示，经牛膝白芍配伍干预后，肾组织中抗氧化因子SOD活性升高，氧化应激产物MDA水平降低，提示牛膝白芍各比例配伍具有协同作用，且2∶3和3∶2为其协同增效作用的最佳比例。

Nrf2/HO-1信号通路是细胞内调控氧化应激反应的重要途径。Nrf2是维持体内氧化与抗氧化系统平衡的新型核转录因子[16]。在氧化应激条件下，Nrf2从Keap1中分离出来，并激活下游的细胞保护基因[17]。解离后，Nrf-2快速进入细胞核内，而进入细胞核内的Nrf-2可以诱导SOD和谷胱甘肽的表达，减少脂质过氧化物MDA生成，并启动下游抗氧化酶HO-1的转录，从而发挥保护器官免受氧化应激损伤的作用[18]。本研究结果显示，经牛膝白芍2∶3和3∶2配伍干预小鼠后，肾组织Nrf2和HO-1表达水平均显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平均显著升高，促凋亡蛋白Bax表达均显著降低，说明牛膝白芍配伍可通过激活Nrf2/HO-1通路抑制肾组织氧化应激及细胞死亡。同时，模型组肾组织中Nrf2和HO-1表达水平也升高，这说明肾在出现损伤时，其同样会以上述方式进行代偿性抗氧化应激。

本研究提示：牛膝白芍配伍具有协同增效的肾保护作用，其作用机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路，抑制氧化应激改善肾损伤有关，这为牛膝白芍配伍的临床应用提供了实验依据。

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基金资助:国家自然科学基金资助项目(82074148);国家和黑龙江省大学生创新创业基金资助项目(202211230036,S202211230045);齐齐哈尔医学院研究生创新基金资助项目(QYYCX2022-19,QYYCX2022-21);齐齐哈尔市科技局联合引导基金资助项目(LSFGG-2023041);

文章来源:陆彭,康达,刘洺岐,等.牛膝白芍颗粒配伍对肝阳上亢型高血压肾损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(22):3285-3289.