西红花，亦称番红花（Crocus sativus L.）或藏红花，为花体的干燥柱头，它作为一味活血祛瘀、镇静催眠的中药在我国具有很长的使用历史。藏红花中含有的主要活性成分有西红花苷、西红花苦苷、西红花醛、西红花酸等，其中西红花苷-Ⅰ（Saffron glycoside-I）含量最高，具有多种药理活性，其抗抑郁药效在多种抑郁模型动物中得到验证[1-2]。最新研究发现，在较低剂量下，西红花苷-Ⅰ抗抑郁作用起效慢，需要连续给药数周后才能显示抗抑郁作用，而较高剂量西红花苷-Ⅰ单次口服给药就可以发挥快速抗抑郁作用[3]，初步研究表明，西红花苷-Ⅰ抗抑郁药效与其特异性作用于伏隔核多巴胺D1神经元，调控c AMP有关。但深入的分子机理仍然不够明了。

虽然前期研究发现西红花苷-Ⅰ具有快速、显著的抗抑郁效果，但是药代动力学研究表明，口服西红花苷-Ⅰ生物利用度低[4-5]，存在明显的PK-PD不相关问题。进一步发现，口服西红花苷-Ⅰ后，西红花苷-Ⅰ主要通过肠道菌群代谢生成西红花苷元（Saffron aglycone），原型药及主要代谢物西红花苷元均主要蓄积在肠道，西红花苷-Ⅰ极少进入血液循环系统和中枢神经系统；而西红花苷元部分进入循环系统，很少进入中枢神经系统[5]。为探索西红花苷-Ⅰ发挥抗抑郁药效的分子机理，本研究借助药理学、代谢组学手段，聚焦于口服西红花苷-Ⅰ在体内药效活性物质、体内药效物质基础进行药效对比研究、内源性小分子代谢组学、神经递质研究，探索西红花苷-Ⅰ抗抑郁的药效物质基础和可能的代谢调控机理。

1、材料与方法

1.1主要仪器

JA1003P型分析天平（上海越平科学，中国，d=1 mg);UW 120D型分析天平（Shimadzu，日本，d=0.1 mg/0.01 mg);VORTEX-2涡旋混合装置（GENIE，美国）；Milli-Q Gradient A10超纯水机（Millipore Inc，德国）；悬尾箱与5 L圆筒玻璃杯（定制）；社交互动测试箱（42 cm x 42 cm，定制）；C270高清摄像头（罗技，美国）；行为学录制软件Webcam Software(Logitech，中国）；Anymaze动物行为学视频分析软件（Stoelting，美国）。

HPLC-q TOF/MS包含岛津高效液相色谱系统（Shimadzu,Japan）及q TOF-MS 5600(AB SCIEX,Foster City,CA);LC/MS-MS含有岛津高效液相色谱系统（Shimadzu,Japan）及美国AB SCIEX公司API 5500(Foster City,CA）及Analyst1.6.1工作站。

1.2药品与试剂

西红花苷-Ⅰ（纯度>96%）与西红花苷元、芍药苷、水飞蓟宾（纯度>98%）均购自成都普瑞法生物科技有限公司；羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂有限公司；异甘草酸镁注射液（10 m L∶0.5 g）来源于正大天晴药业集团有限公司。其他试剂均为市售分析纯，多巴胺（dopamine,DOPA）、5-羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（γ-GABA）、去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、谷氨酸（glutamic acid,GLUT）标准品均来源于阿拉丁生化科技股份有限公司；LPS脂多糖（来源于大肠杆菌0111:B4，货号L2630）来源于美国Sigma-Aldrich公司；IL-6 ELISA KIT试剂盒（货号EM004-96）和TNF-α ELISA KIT试剂盒（货号EM008-96）均来源于上海依科赛生物公司。

1.3实验动物

SPF级雄性CD-1退育小鼠（40～50 g,7月龄）与雄性C57BL/6J小鼠（18～23 g,6周龄）购自浙江维通利华有限公司。所有动物饲养于中国药科大学动物实验中心，期间给予标准饲料和饮用水，室温保持在（23±2）℃，相对湿度为（50±15)%,12 h昼夜交替。所有动物开始实验前均在新的环境中适应7 d。本研究由中国药科大学实验动物伦理委员会批准，编号2021-09-039。

1.4主要溶液配制

0.5%CMC-Na溶液：称取0.5 g羧甲基纤维素钠粉末，先加入100 m L常温超纯水中，充分吸水膨胀，再于65℃水浴状态下搅拌使其充分溶解。取西红花苷-Ⅰ（低、高剂量分别为100、300 mg/kg）、西红花苷元（100 mg/kg）、水飞蓟宾（30 mg/kg）、芍药苷（150 mg/kg）均由0.5%CMC-Na配制成混悬液给药，异甘草酸镁溶液给药剂量为15 mg/kg。

1.5模型动物与炎症因子、行为学测定方法

模型动物的建立及行为学测试方法主要参考已发表文献。本研究主要建立：慢性社交挫败应激模型（CSDS)[6]、慢性不可预知应激模型（CUMS）小鼠[3]及LPS诱导的炎症模型[7]。行为学测试内容包括：社交互动测试（SIT)[7]、强迫游泳测试（FST)[8]、尾部悬挂测试（TST)[9]及糖水偏好实验（SPT)[3]。抑郁模型动物在造模成功后，每日单剂量给予西红花苷-Ⅰ（300 mg/kg）或西红花苷元（100 mg/kg），给药后1、3 d进行行为学评价。LPS炎症模型动物在造模前4 d给予西红花苷-Ⅰ（300 mg/kg）或抗炎药与之联用，最后一次给药2 h后，腹腔注射LPS(0.5 mg/kg，生理盐水溶解），4 h后眼眶后静脉取血浆进行炎症因子IL-6和TNF-α测定。使用ELISA KIT试剂盒对小鼠血浆中的IL-6和TNF-α浓度进行检测。按照试剂盒微量法进行测定，利用Bio Tek荧光酶标仪在450 nm处测定吸光度计算实际含量。

1.6非靶向代谢组学研究

血浆样品处理与测定：给药24 h后，采集动物全血，离心分离血浆备用。取50μL血浆，加入200μL含氯苯丙氨酸（500 ng/m L）的甲醇溶液，振荡5 min后在4℃静置1 h，在18 000 r/min转速下离心15 min后，转移200μL上清液至1.5 m L离心管中，用真空蒸发浓缩仪减压挥干。挥干后的样品加入100μL超纯水复溶后，涡旋震荡5 min，随后在18 000 r/min转速下离心10 min，重复3次后，转移60μL上清至进样瓶中准备进样分析。随机取数个血浆样品，混合后，按照上述同样的步骤处理制成QC样品。进样时每10个样品插入一个QC样品。采用课题组已经建立的HPLC-q TOF/MS方法[10-11]，进样10μL对血浆样品进行非靶向代谢组学检测。

肠内容物样品处理与测定：给药24 h后，采集小鼠20 mg结肠内容物，加入800μL含500 ng/m L氯苯丙氨酸的80%甲醇水溶液，加入锆珠涡旋震荡2 min，混匀后在4℃环境下静置1 h，在18 000 r/min转速下离心10 min，转移60μL上清至进样瓶，进样分析。

1.7靶向神经递质组检测方法

1.7.1溶液配制

取多巴胺、5-HT、GABA、c AMP、去甲肾上腺素、谷氨酸对照品10 mg，转移至10 m L容量瓶，加入甲醇定容至刻度线，颠倒摇匀，配成终浓度为1 mg/m L的储备液，保存在-80℃冰箱备用。测定前，分别取各标准品储备液等体积混合，再加入超纯水稀释，得到多巴胺、5-HT、GABA、c AMP、去甲肾上腺素、谷氨酸等浓度的混合工作液。

取45μL空白血浆基质或空白结肠内容物匀浆液，分别加入不同浓度的含神经递质混合工作液5μL，涡旋混匀后，配制成多巴胺、5-HT、GABA、c AMP、去甲肾上腺素、谷氨酸于小鼠血浆中的终浓度都分别为1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng/m L的标准血浆样品。随后照前述血浆样品处理方法进行，经LC-MS/MS进样分析。

1.7.2样品处理与分析

参考上述非靶向代谢组学的样品处理方法，对血浆样品、结肠内容物进行处理，离心后转移60μL上清至进样瓶中，参考已报道[12]的文献测定方法进样分析。

1.8数据分析

常规测定数据以平均值±标准差（）表示；统计检验中，采用非配对t检验确定两组间差异的显著性；采用单因素方差分析（ANOVA）评价多组间差异，P<0.05为差异具有统计学意义（Graph Pad Prism 7.0）。

参考文献方法采用SIMCA-P14.1软件（Umetrics,Umeå，Sweden）进行代谢组学数据进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA)[13-14]，采用KEGG 、Metabo Analyst 3.0数据库进行代谢通路分析、热图分析。

2、结果

2.1西红花苷-Ⅰ与西红花苷元抗抑郁药效研究

连续10 d的慢性社交挫败应激，在最后一次施加应激的24 h后对CSDS抑郁模型小鼠进行社交测试，筛选社交系数小于1的抑郁易感（SS）小鼠，按照社交系数评分随机分成三组：西红花苷-Ⅰ（300 mg/kg）灌胃组、西红花苷元（100 mg/kg）灌胃组，以空白溶剂灌胃的对照组。

给药前各组小鼠进行了行为学测试，结果发现：在给空白溶剂的SS组，小鼠表现出社交回避与行为绝望等抑郁样行为。与正常组相比，SS小鼠在社交互动测试中的社交系数明显降低、强制游泳测试和尾悬测试中的不动时间显著升高。

在西红花苷-Ⅰ或西红花苷元经过3次给药（每天1次，总共3 d）后，给药72 h后的SS小鼠的社交系数得到了显著上升，提示西红花苷-Ⅰ及西红花苷元均可改善SS小鼠的社交回避行为（Fig.1A,D），同时FST和TST指标也得到了显著的下调，提示西红花苷-Ⅰ及西红花苷元显著改善了SS小鼠的行为绝望（Fig.1 B、C、E、F），显示良好抗抑郁效果。

2.2西红花苷-Ⅰ对LPS诱导的模型动物抗炎作用

炎症因子为体内具有生理活性的分子，临床前和临床研究发现促炎因子在抑郁样行为发作中发挥了重要作用[15]。而重度抑郁患者TNF-α、IL-6水平升高明显[16]，本文因此研究了CSDS抑郁模型小鼠外周血浆中主要炎症因子IL-6、TNF-α的变化。发现单用西红花苷-Ⅰ对IL-6和TNF-α水平降低并不显著（Fig.2A、2D）。西红花苷-Ⅰ与芍药苷、水飞蓟宾或异甘草酸镁合用，显著抑制LPS诱导的炎症因子IL-6和TNF-α的增加（Fig.2A、2D）。提示西红花苷-Ⅰ对LPS诱导的炎症因子无明显抑制作用。

进一步研究了单用芍药苷、水飞蓟宾、异甘草酸镁以及三种抗炎药物成分各自与西红花苷-Ⅰ联用对小鼠抑郁样行为的改善作用。结果显示，芍药苷、水飞蓟宾、异甘草酸镁单独使用未显著改善小鼠的社交回避（Fig.2B），西红花苷-Ⅰ给药后24 h(Fig.2E），西红花苷-Ⅰ给药显著降低强迫游泳不动即可改善社交回避。而西红花苷-Ⅰ与抗炎药物联时间，与抗炎药物联用后，改善游泳不动时间的绝用后，改善社交回避更加显著（Fig.2C）；强迫游泳望行为更加显著（Fig.2F）。提示西红花苷-Ⅰ抗抑郁试验表明，抗炎药物不能降低强迫游泳不动时间作用不依赖于抗炎作用。

2.3西红花苷-Ⅰ对内源性小分子代谢调节作用

采用主成分分析PCA和PLS-DA方法对CUMS、CS-DS鼠、西红花苷-Ⅰ给药后血浆样品特征离子及质谱响应信号进行分析。结果显示正常对照组、模型组、给药组组内样本各自相对集中（Fig.3A、3C）。PLS-DA分析显示对照组血浆样品（C，绿色）与CUMS或CSDS模型组（M组，均标黄色）远离(Fig.3B、3D），提示CUMS、CSDS抑郁模型小鼠内源性物质基础（血浆中小分子代谢物）出现异常。较高剂量西红花苷-Ⅰ（H，蓝色）给药后，有向正常组靠近趋势，较低剂量西红花苷-Ⅰ（L，红色）调节作用弱于较高剂量，提示西红花苷-Ⅰ对两种模型动物的内源性物质具有整体调节作用。

2.4西红花苷元对内源性小分子的代谢调节作用

采用HPLC-q TOF/MS测定技术对CSDS模型小鼠、西红花苷元给药组小鼠血浆中内源性小分子进行分析。经与谱库及标准化合物比对，初步鉴定76种内源性小分子。PLS-DA分析结果显示对照组（C组）与抑郁易感的CSDS模型组（SS组）、西红花苷元给药组各组内样品相对聚集，各组间相对分离（Fig.4A）。提示慢性压力应激诱导SS小鼠血浆代谢组发生明显变化；与西红花苷-Ⅰ给药效果类似，西红花苷元给药组（H）与模型组偏离，并有向正常对照组靠近趋势。提示西红花苷元可以在一定程度上调节CSDS模型小鼠血浆代谢表型。

对肠内容物进行分析，经与谱库及标准化合物比对，初步鉴定75种内源性小分子。PLS-DA分析结果同样显示对照组（C组）与抑郁易感的CS-DS模型组（SS组）、西红花苷元给药组各组内样品相对聚集，各组间相对分离（Fig.4B）。提示慢性压力应激诱导SS小鼠肠内容物代谢组发生明显变化；西红花苷元给药组（H）与模型组偏离，并有向正常对照组靠近趋势，表现出与西红花苷-Ⅰ类似的给药效果。以上结果提示西红花苷元可在一定程度上调节SS小鼠肠内容物代谢表型。

通过对血浆样品组间差异小分子进行分析，按VIP(Variable importance）值大于1、统计差异P值小于0.05的标准进行筛选，发现抑郁模型组有26个小分子明显异常，不同于正常对照组。通过导入KEGG数据库进行的通路分析和富集分析，显示异常变化的小分子物质主要涉及嘌呤代谢、嘧啶代谢（Fig.4C）。热图显示，嘌呤代谢通路中鸟苷水平显著升高，黄嘌呤、肌苷等水平显著降低（Fig.5A），而西红花苷元给药后可明显下调鸟苷、上调黄嘌呤、肌苷，提示压力应激导致血浆嘌呤代谢异常，西红花苷元可较好调节异常的嘌呤代谢趋向正常。嘧啶代谢通路中CMP、d CDP、5-胸苷酸水平显著升高，而d CDP、尿嘧啶的水平显著降低；而西红花苷元明显调节了上述变化，提示压力应激导致血浆嘧啶代谢异常，西红花苷元可较好地调节嘧啶代谢异常。

同上述方法对结肠内容物中内源性差异小分子进行分析，发现SS组结肠内容物有40个小分子明显不同于正常对照组。通路分析和富集分析显示，SS组肠道内容物中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、嘌呤代谢异常（Fig.4E），热图显示抑郁易感CSDS模型小鼠的结肠内容物中谷氨酸、谷氨酰胺等水平显著变化（Fig.5B）；而西红花苷元可调控谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等水平，使之趋向正常水平。以上发现提示压力应激导致肠内容物代谢物紊乱，而西红花苷元对丙氨酸、天冬氨酸和神经递质谷氨酸代谢具有较好的调节作用。

另外，抑郁易感CSDS模型小鼠嘌呤代谢通路中谷氨酰胺水平显著升高，AMP、d AMP、黄嘌呤、GMP、2'-脱氧鸟苷5'-单磷酸等水平显著降低，西红花苷元不仅下调谷氨酰胺的水平，而且较为有效地上调上述物质，以上研究结果提示压力应激导致肠道内容物中嘌呤类物质代谢异常，西红花苷元对其具有较好调节作用。

2.5西红花苷元对血浆及肠道内容物神经递质的影响

对血浆、结肠内容物中相关神经递质进行靶向递质组学研究，发现CSDS造模成功后，血浆中5-HT、谷氨酸、去甲肾上腺素以及g-GABA水平升高，而西红花苷元给药较为明显地调节了这些神经递质水平（Fig.6A），提示CSDS造模应激可导致模型动物血浆中相关神经递质发生变化，西红花苷元对血浆这些神经递质具有调节作用。另外发现CSDS造模成功后，结肠内5-HT、谷氨酸以及去甲肾上腺素水平降低，西红花苷元对这些神经递质具有较好调节作用（Fig.6B），提示慢性社交挫败压力应激导致模型动物肠道内容物中相关神经递质发生变化，西红花苷元对肠道中这些神经递质具有调节作用。

3、讨论

西红花苷-Ⅰ发挥抗抑郁药效的体内活性药物分子：前期研究发现西红花苷-Ⅰ对慢性不可预知应激、慢性束缚应激和慢性社交挫败应激抑郁模型应激引起的兴趣缺失、绝望和社交回避等抑郁样行为均具有快速、显著的抗抑郁效果，其起效速度大幅领先临床一线抗抑郁药物药氟西汀、西酞普兰，与快速抗抑郁药物氯胺酮相当[3]。然而，PK-PD研究表明，口服西红花苷-Ⅰ吸收差、生物利用度低情况下，其抗抑郁药效显著。反而初步研究发现静脉注射西红花苷-Ⅰ，虽然体内暴露水平高，但无明显药效，提示西红花苷-Ⅰ的循环系统中高暴露无益于其发挥抗抑郁效果。进一步发现，口服西红花苷-Ⅰ后，西红花苷-Ⅰ主要通过肠道菌群代谢生成西红花苷元[5]，原型药及主要代谢物西红花苷元主要蓄积于肠道，较少进入血液循环系统，极少进入中枢神经系统。提示西红花苷-Ⅰ药效与其在肠道中的暴露密切相关。深入研究还发现在抗生素清除或抑制肠道菌群的条件下，西红花苷-Ⅰ在肠道的代谢生成西红花苷元显著减少，药效消失[5]。相反，在肠道菌群抑制条件下，直接口服西红花苷元，其抗抑郁药效不受影响，提示西红花苷-Ⅰ的抗抑郁药效与其在肠道菌群的代谢有关，并依赖于西红花苷元的生成。本研究发现，在等摩尔量给药条件下，西红花苷元显示出与西红花苷-Ⅰ近似药效，进一步提示西红花苷-Ⅰ抗抑郁药效的体内活性分子为西红花苷元。

西红花苷-Ⅰ与西红花苷元发挥抗抑郁作用与炎症因子的调节作用：大量研究提示抑郁与炎症密切相关[15,17]。为研究西红花苷-Ⅰ/西红花苷元抗抑郁作用与炎症因子调节之间的联系，本研究首先采用LPS诱导的炎症模型，对比研究西红花苷-Ⅰ与天然来源的三种常用抗炎活性成分-芍药苷、水飞蓟宾、异甘草酸镁对主要炎症因子的调节作用，发现三种常用抗炎成分显著抑制IL-6和TNF-α的增加，而西红花苷-Ⅰ无明显影响，提示西红花苷-Ⅰ对炎症因子抑制作用较弱。

进一步比较了单独应用抗炎药物成分芍药苷、水飞蓟宾、异甘草酸镁以及西红花苷-Ⅰ对CS-DS抑郁样行为的改善作用，发现除西红花苷-Ⅰ外，其他三种抗炎药物成分均无法改善社交回避行为和降低强迫游泳不动时间。西红花苷-Ⅰ虽然无明显抗炎作用，但抗抑郁药效显著，提示西红花苷-Ⅰ的抗抑郁作用与炎症因子调节无关。但十分有趣的是，西红花苷-Ⅰ与抗炎药物成分联用，可更加显著地改善小鼠的社交回避、绝望行为，提示西红花苷-Ⅰ与抗炎药物成分合用有利于加强其抗抑郁效果。

西红花苷-Ⅰ与西红花苷元对抑郁模型小鼠内源性小分子及神经递质的代谢调节：代谢组学研究发现CUMS、CSDS抑郁模型小鼠内源性小分子均出现明显的异常改变，西红花苷-Ⅰ对模型小鼠异常的代谢表型产生影响，发挥调节作用。进一步发现西红花苷元不仅对CSDS抑郁模型小鼠循环系统内源性小分子、神经递质发挥调节作用，还能对肠道内源性小分子、神经递质发挥调节作用。其中，西红花苷元对循环系统和肠道嘌呤代谢、5-HT、谷氨酸、去甲肾上腺素以及g-GABA均具有调节作用，提示其抗抑郁作用与上述代谢调节有关。

红花苷元具有与西红花苷-Ⅰ相似的快速抗抑郁药效，西红花苷-Ⅰ抗抑郁药效与其体内主要代谢物西红花苷元有关。西红花苷元可调节抑郁模型小鼠循环系统、肠道中内源性小分子、神经递质，其抗抑郁药效与其与对炎症因子调节无关。

参考文献:

[12]张蕾,孔令提,孙兰,等. LC-MS/MS同时测定小鼠脑组织中7种神经递质含量[J].中国实验方剂学杂志, 2013, 19(20):132.

[13]阿基业.代谢组学数据处理方法—主成分分析[J].中国临床药理学与治疗学, 2010, 15(5):481-489.

[14]阿基业,何骏,孙润彬.代谢组学数据处理-主成分分析的十个要点问题[J].药学学报, 2018, 53(6):929-937.

基金资助:国家创新药物重大专项(2017ZX09301013);江苏省前沿引领基础研究计划项目(BK20192005);南京医科大学第一附属医院国家自然科学基金青年基金培育计划(PY2022001);

文章来源:阿楠,肖繁,宋亚恒,等.西红花苷-Ⅰ抗抑郁药效的物质基础研究[J].中国临床药理学与治疗学,2024,29(12):1409-1418.