动脉粥样硬化（AS）是动脉硬化性血管疾病中重要且常见的一种，是多种心脑血管疾病（如冠心病、血栓栓塞性疾病和脑血管病等）的病理基础[1]。进入21世纪以来，全球AS的发病率呈逐年上升趋势，对人类健康造成了严重威胁[2]。AS的发病机制尚未明确。近年来，多项研究提示，慢性炎症在AS的发生发展中发挥着重要作用[3,4]。Toll样受体4(TLR4）作为Toll样受体家族（TLRs）中的一员，与配体结合后能够促进核因子κB(NF-κB）发生核转移，从而激活下游炎症因子参与到AS的各个阶段，故抑制TLR4/NF-κB信号通路可能是改善AS的潜在机制之一[5,6]。

现代医学对AS的治疗方法包括手术治疗与药物治疗，但二者均存在一定的局限性，如患者经皮冠状动脉腔内成形术后易发生再狭窄，长期服用他汀类药物会对其肝脏、肌肉、肾脏以及糖代谢等造成负面影响，二者联合则可能引发横纹肌溶解[7,8]。中医认为，AS属本虚标实之证，阴虚、阳虚、气虚为本，血瘀、痰浊、气滞、热毒、寒凝为标，可归“脉痹”“积聚”的范畴[9]。心脉康由广州中医药大学东莞医院叶小汉教授创方，以鳖甲、三棱、莪术、枳实、制胆星和石斛等药材组成，具有软坚散结、益气通脉的功效[10]。临床研究证实，心脉康对AS患者具有显著的治疗作用[11,12]，但其分子机制尚未明确。本研究通过观察心脉康对兔AS的影响，基于TLR4/NF-κB信号通路探究其改善兔AS的作用机制，旨在为心脉康的机制研究提供参考。

1、材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括BX41TF型光学显微镜（日本Olympus公司）、LEO-1430VP型扫描电子显微镜（德国Zeiss公司）、ModularP800型全自动生化分析仪（瑞士Roche公司）、BondmaX型全自动免疫组化染色机（德国Leica公司）、PowerWaveXS2型酶标仪（美国BioTek公司）、JS-680A型自动凝胶成像分析仪（上海培清科技有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

心脉康片（批号Z20110041，规格0.75g）由东莞市中医院提供；辛伐他汀片（批号R018651，规格20mg）购自荷兰MerckSharpVDohmeB.V.公司；0.5%油红O染液（货号SLBG0158V）购自美国Sigma公司；三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号分别为23743986、23451355、23377464、23460238）均购自美国ThermoFisherScientific公司；白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒和TLR4、NF-κBp65免疫组化试剂盒（批号分别为A13267、A12347、A12567、A17267）均购自美国ABclonalTechnology公司；苏木精染液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒（批号分别为C0107、P0012A、P0012S、P0018FS）均购自上海碧云天生物技术有限公司；山羊抗小鼠TLR4单克隆抗体、山羊抗小鼠NF-κBp65多克隆抗体、山羊抗小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG）二抗（批号分别为1358、8242、5174、7074）均购自美国CellSignalingTechnology公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。

1.3 实验动物

本研究所用实验动物为普通级5月龄雄性新西兰兔，共50只，体质量1.8～2.3kg，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物使用许可证号为SYXK（粤）2018-0001。所有动物均饲养于普通级动物实验室内，温度为20～26℃，相对湿度为40%～70%，昼夜明暗交替（12h/12h）。高脂饲料（含1%胆固醇、5%猪油、94%普通饲料）、普通饲料均由广州中医药大学实验动物中心提供。本研究方案已通过广州中医药大学实验动物管理和伦理委员会批准，批件号为ZSLL-2015-45。

2、方法

2.1 造模

参考文献[13]，采用高脂饲料喂养与腹主动脉内膜球囊损伤结合的方法复制兔AS模型，具体操作如下：用高脂饲料（100g/d）喂养新西兰兔2周后，再行腹主动脉内膜球囊损伤术——经耳缘静脉注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉后，穿刺右股动脉，将内径3.5mm、长15mm的球囊导管送入腹主动脉（插入深度约2.0cm），充盈球囊并缓慢回拉球囊至动脉切口处，反复回拉3次，以造成腹主动脉内膜损伤和剥脱，术后继续以高脂饲料喂养。术后10周根据油红O的染色情况判断是否建模成功。

2.2 分组与给药

将50只新西兰兔以普通饲料喂养2周后，随机分为假手术组、模型组、辛伐他汀组[阴性对照，2.60mg/（kg·d）]和心脉康低、高剂量组[0.21、0.84g/（kg·d）]，每组10只。假手术组兔给予普通饲料喂养，只分离结扎股动脉但不损伤腹主动脉内皮，其余各组兔均按“2.1”项下方法复制AS模型。术后10周，假手术组和模型组兔灌胃生理盐水，各药物组灌胃相应药液（溶剂均为生理盐水），给药体积均为100mL，每天给药1次，连续12周，给药剂量均依据本课题组预实验结果设置。

2.3 采样方法

末次给药后，用4%水合氯醛溶液麻醉各组兔，收集其腹主动脉血40mL后，处死，分离腹主动脉。血样于室温下放置30min后，以5000r/min离心15min，取上层血清，备用。

2.4 兔腹主动脉的病理观察

取各组兔腹主动脉，以石蜡包埋后切片（厚度约5μm），脱蜡至水并经水洗后，在异丙醇中放置5min，用滤纸吸去异丙醇，加入0.5%油红O染色30min；用水清洗3次，加入苏木精染色5min；用盐酸-乙醇溶液（1∶100,V/V）分色、氨水返蓝后，用中性树胶封片，使用光学显微镜观察其腹主动脉的病理变化（红褐色为血脂沉积）。

2.5 兔腹主动脉内壁的病理观察

取各组兔腹主动脉，用磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.4）清洗表面后，快速放入2.5%戊二醛固定液中固定4h；用PBS清洗5min×4次，再放入1%锇酸固定液中固定1h；用PBS清洗5min×4次，依次放入70%、80%、90%、100%乙醇中脱水10min，彻底干燥后，使用扫描电子显微镜观察其腹主动脉内壁的病理变化。

2.6 兔血脂指标含量的检测

取各组兔腹主动脉血清样品适量，按照相应试剂盒说明书方法操作，使用全自动生化分析仪检测其血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的含量。

2.7 兔血清中IL-1β、IL-6含量的检测

采用ELISA法进行检测。取各组兔腹主动脉血清样品适量，按照相应试剂盒说明书方法操作，使用酶标仪检测其血清中IL-1β、IL-6的含量。

2.8 兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65含量的检测

采用免疫组化法进行检测。取各组兔腹主动脉，以石蜡包埋后切片（厚度约5μm），按照相应试剂盒说明书方法操作，使用全自动免疫组化染色机分别进行TLR4和NF-κBp65免疫组化染色，使用光学显微镜观察并采集放大时的显微图像，同时运用ImageJv1.8.0图像分析软件计算兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65在465nm波长下的积分光密度（IOD），并以此表示两者含量。

2.9 兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65蛋白表达水平的检测

采用Westernblot法进行检测。取各组兔腹主动脉，经裂解、匀浆、静置后，以12000r/min离心10min，获取蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度后，煮沸5min使蛋白变性。取变性后的蛋白样品经SDS-PAGE分离，转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以5%脱脂奶粉于室温下封闭2h后，加入TLR4、NF-κBp65、GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1000、1∶200、1∶1000),4℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗涤10min×3次，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗（稀释比例为1∶15000），室温孵育1h；用TBST缓冲液洗涤10min×3次，加入ECL化学发光显色液显影，于自动凝胶成像分析仪中成像。使用SensiAnsys13.0软件进行分析，以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。

2.10 统计学方法

采用SPSS23.0软件对数据进行统计分析。数据均以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验（方差齐）或Dunnett’s检验（方差不齐）。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 兔腹主动脉的病理变化

假手术组兔的腹主动脉管腔内可见少许脂质，未见明显斑块和血管内皮损伤。与假手术组比较，模型组兔的腹主动脉管腔内膜富含脂质，管壁厚度和斑块面积均明显增加，可见明显的血管内皮损伤。与模型组比较，心脉康低剂量组兔的腹主动脉结构相对完整，管腔内膜脂质沉积较少；心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔的腹主动脉结构正常，局部有小灶性钙化颗粒物沉积，病变轻微，斑块小，弹力板基本完整。结果见图1。

3.2 兔腹主动脉内壁的病理变化

假手术组兔的腹主动脉内壁光滑，未见明显肿胀、损伤、粥样硬化斑块和泡沫细胞。与假手术组比较，模型组兔的腹主动脉内壁可见许多粥样硬化斑块，在斑块表面可见纤维帽和泡沫细胞，在硬化斑块上可见黏附的巨噬细胞，血管内皮损伤明显。与模型组比较，心脉康低剂量组兔的腹主动脉内壁斑块面积缩小，血管内皮损伤较轻；心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔的腹主动脉内壁斑块明显较少，血管内皮相对完整，未见明显损伤。结果见图2。

3.3 兔血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量变化

与假手术组比较，模型组兔血清中TC、TG、LDL-C含量均显著升高（P<0.01),HDL-C含量显著降低（P<0.05）。与模型组比较，心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔血清中TC、TG、LDL-C含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），各药物组HDL-C含量和心脉康低剂量组TC、TG、LDL-C含量差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

3.4 兔血清中IL-6、IL-1β的含量变化

与假手术组比较，模型组兔血清中IL-6、IL-1β含量均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔血清中IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.01），心脉康低剂量组上述指标含量差异均无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。

3.5 兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65的含量变化

与假手术组比较，模型组兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65含量均显著升高（P<0.01）。与模型组比较，各药物组兔腹主动脉组织中TLR4（除心脉康低剂量组外）、NF-κBp65含量均显著降低（P<0.01）。结果见图3、图4、表3。

3.6 兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65蛋白的表达水平变化

与假手术组比较，模型组兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65蛋白的表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，各药物组兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κBp65蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结果见图5、表4。

4、讨论

AS是一种慢性炎症性疾病，是由脂质过度积累诱发内皮细胞、白细胞和内膜平滑肌细胞共同参与的动脉病变[14]。心脉康是由鳖甲、三棱、莪术、枳实、制胆星和石斛等药材组成，其中鳖甲可滋阴潜阳、软坚散结；三棱和莪术可破血消积、行气止痛，现代药理学研究提示两者均能够抑制炎症、降低全血黏度和阻止血栓形成；枳实可破气散痞、消积化痰；制胆星可清热化痰，配合诸药可增软坚散结之功；石斛擅益胃生津、滋阴清热，其提取物亦可降低全血黏度、抑制血栓形成；诸药合用，共奏软坚散结、益气通脉之功[15,16,17]。

在AS病变过程中，血浆中的细胞因子和脂蛋白颗粒通过受损的血管内皮渗入至内皮下空间，通过氧化修饰等反应成为具有细胞毒性的化学物质，从而促进炎症反应和AS进程[18]。本研究油红O染色和扫描电子显微镜观察结果提示，高剂量心脉康能够保护AS模型兔的血管内皮，抑制其粥样硬化斑块形成。脂质代谢异常是AS最重要的危险因素之一[19]，本研究对各组兔的血脂指标进行分析，结果提示，高剂量心脉康能够改善AS模型兔的血脂异常，下调血清中TC、TG和LDL-C含量，干预AS的进程。

炎症在AS的所有阶段都起着重要作用，是其起始和发展过程中生理和病理变化的共同基础[20]。已有研究表明，炎症因子IL-6和IL-1β的过度表达能够提升炎症细胞的黏附能力，IL-1β还可降低血栓调节素的表达，破坏凝血与抗凝血功能的平衡，导致血管内部凝血，从而促进AS的进程[21]。本研究结果提示，高剂量心脉康能够下调AS模型兔血清中IL-6和IL-1β的含量，抑制炎症反应，干预AS的进程。

有学者指出，心脉康可能通过降低血脂、减轻过氧化损伤等途径来抑制兔AS的形成[22,23]。心脉康联合化学药治疗具有较好的抗炎效果[24]。TLR4是介导天然免疫TLRs家族中的一员，是一种位于细胞膜表面的跨膜蛋白，参与多种免疫及炎症反应，其在AS内皮细胞和斑块上的表达水平明显升高[25]。NF-κB是炎症最重要的调节因子之一，其主要形式为p50和p65组成的二聚体，参与AS的病理进程[26,27]。有研究发现，ApoE-/-小鼠经NF-κB抑制剂干预后，其体内泡沫细胞的形成受到明显抑制[28]。TLR4/NF-κB信号通路是机体重要的炎症信号转导途径之一，血管内皮细胞内TLR4蛋白表达水平的上调能够激活NF-κB，诱导肿瘤坏死因子α、IL-6和IL-1β等促炎性细胞因子的产生和释放，从而促进AS斑块的形成[29]。相关研究指出，抑制TLR4/NF-κB信号通路能够下调炎症因子的表达，从而减轻血管内皮细胞的受损程度，延缓AS的进程[30,31]。本研究通过构建AS模型兔，探究心脉康对TLR4/NF-κB信号通路及炎症因子表达的影响，结果显示，与模型组比较，心脉康低、高剂量组兔腹主动脉组织中TLR4（除低剂量组外）、NF-κBp65含量及其蛋白的表达水平均显著降低，提示TLR4/NF-κB信号通路可能是心脉康改善兔AS的靶点之一。

综述所述，心脉康可能通过下调TLR4、NF-κBp65的表达，抑制炎症反应，从而延缓AS的发展。

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文章来源：周智慧,陈贺,吴锦波,叶小汉.基于TLR4/NF-κB信号通路探究心脉康改善兔动脉粥样硬化的机制[J].中国药房,2021,32(22):2736-2742.