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苍耳子含药血清对IgE致敏肥大细胞脱颗粒调控作用的实验研究

2023-07-10 210 上传者：管理员

摘要：探究苍耳子含药血清对免疫球蛋白E(IgE)致敏的肥大细胞脱颗粒的抑制作用和调控途径。方法:小鼠喂服苍耳子水溶液，制备含药血清；MTT法检测不同浓度苍耳子含药血清对肥大细胞活性的影响。IgE致敏肥大细胞，实验分为正常对照组、模型对照组、10%苍耳子含药血清组和富马酸酮替芬组。药物干预后，乳酸脱氢酶(LDH)法和甲苯胺蓝染色检测细胞毒性和脱颗粒率；ELISA检测细胞炎症活性介质β氨基己糖苷酶A (β-hexosaminidase A)、白三烯C4(LTC4)和组胺(histamine)的释放情况；F-actin微丝染色观察细胞形态变化。结果:苍耳子含药血清对正常肥大细胞活性无明显影响(P>0.05)。与正常对照细胞相比，模型对照组细胞毒性和脱颗粒率增加，β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的释放显著增加，细胞变形数量显著增加(P<0.01)。与模型对照组相比，10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞毒性和脱颗粒率显著降低，β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的释放显著下降，细胞变形数量显著减少(P<0.01)。结论:苍耳子含药血清可抑制肥大细胞变形、脱颗粒，并减少β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的释放。

关键词：
β氨基己糖苷酶A
白三烯C4
肥大细胞脱颗粒
苍耳子
血清药理学
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过敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是机体受到过敏原刺激后导致鼻黏膜组织炎症和生理功能紊乱的一种疾病，属于免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介导的I型超敏类型[1]。近年来，我国过敏性鼻炎患者数量呈现增长趋势[2],空气污染导致儿童患过敏性鼻炎风险逐渐增高[3]。肥大细胞是AR中的主要功能细胞，其被激活脱颗粒释放大量生物活性介质使气道黏膜血管扩张、通透性增加，引起白细胞聚集从而导致气道炎症发生[4,5]。因此，聚焦肥大细胞脱颗粒过程并抑制其脱颗粒可能是治疗AR的有效途径之一。

中药苍耳子(Xanthium sibiricum Patr.)为菊科植物，性味辛、苦、温，具有散风寒、通鼻窍之功效，常用于鼻部疾病的治疗[6]。苍耳子果实成分复杂，现已发现其可作用多个靶点治疗AR[6]。目前，许多研究报道了天然植物能通过抑制肥大细胞脱颗粒而发挥治疗炎症免疫性疾病的作用[7],而苍耳子对肥大细胞脱颗粒的研究尚未完全深入。因此，本研究制备苍耳子含药血清，旨在阐明其对IgE诱导肥大细胞脱颗粒的影响作用，为苍耳子临床治疗AR提供实验室依据。

1、材料与方法

1.1实验材料

大鼠嗜碱性细胞白血病细胞(RBL-2H3):赛百慷(上海)生物技术股份有限公司，货号：iCell-r027。BALB/c小鼠：上海灵畅生物科技有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2018-0003。小鼠白三烯C4、组胺、β氨基己糖苷酶A的ELISA试剂盒：武汉益普生物科技有限公司，货号：MM-0395M1、0548M2、0601M1;乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0017;MTT试剂盒：BBI Life Sciences,货号：E606334;鬼笔环肽-FITC:懋康生物，货号：MX4403;胎牛血清：浙江天杭生物科技；RPMI1640培养基、Trypsin 0.25%(1×)溶液、DMEM:Hyclone;甲苯胺蓝染液：武汉赛维尔生物科技有限公司。BB150细胞培养箱、Micro17R低温高速离心机：Thermo; LRH-150生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；CMaxPlus酶标仪：MD;AE2000光学显微镜：Motic。

1.2苍耳子含药血清制备

苍耳子果实沸水煮2 h进行浓缩成水提物溶液(1 g提取物=20 g原药)。预先抽取小鼠血液制备空白血清。苍耳子水溶液每次以16 mg/kg灌胃小鼠，每天2次，连续5 d。给药结束后，小鼠眼眶取血，3 000 r/min离心15 min,分离含苍耳子药物血清。用预留空白血清稀释得到10%、20%、30%、40%、50%苍耳子含药血清。

1.3 MTT检测细胞活性

对数生长期RBL-2H3细胞接种于96孔板中，加入10%、20%、30%、40%、50%苍耳子含药血清处理4 h;空白对照细胞不做任何处理。PBS清洗，加入20μL MTT溶液孵育4 h; 200μL DMSO溶液，震荡10 min;酶标仪490 nm处检测各孔OD值。细胞活性=(实验组值-空白调零值)/(对照组值-空白调零值)×100%。

1.4细胞致敏及实验分组和给药

RBL-2H3细胞于10%胎牛血清的培养液(含100 U/ mL青霉素，100 mg/L链霉素)中培养。500μg/L anti-DNP Ig E致敏细胞12 h, PBS清洗。100μg/L DNP-HSA,37℃下孵育12 h。细胞分为正常对照组、模型对照组、10%苍耳子含药血清组和富马酸酮替芬组(10-5 mol/L),药物处理4 h。PBS清洗细胞，更换培养基后进行后续实验检测。

1.5观察指标检测

1.5.1细胞毒性

乳酸脱氢酶(LDH)法检测。收集各组细胞上清液。另设置样本对照孔，细胞最大酶活性孔，按照LDH试剂盒说明书，测定LDH含量。细胞LDH释放量(%)=(实验组LDH含量-样本对照孔LDH含量)/(细胞最大酶活性孔LDH含量-样本对照孔LDH含量)×100%。以LDH(%)代表细胞毒性。

1.5.2细胞脱颗粒检测

甲苯胺蓝染色检测。吸弃孔中多余培养液，4%多聚甲醛固定细胞30 min,蒸馏水清洗后甲苯胺蓝试剂染色3～5 min,清洗，倒置显微镜观察细胞形态。正常肥大细胞呈梭形，胞内储存紫色颗粒；脱颗粒细胞形态变圆，胞内紫色颗粒储存减少，计数细胞。脱颗粒率(%)=脱颗粒细胞数/细胞总数×100%。

1.5.3细胞形态观察

F-actin微丝染色检测。细胞消化后制成1×105/mL的细胞悬液。4%多聚甲醛室温下固定细胞30 min, 0.5% TritonX-100通透细胞5 min,鬼笔环肽-FITC与PBS(1∶1 000)避光孵育细胞30 min, PBS清洗，DAPI试剂室温避光孵育2 min, PBS清洗。荧光倒置显微镜下观察变形细胞形态，计数细胞。变形细胞率(%)=圆形或椭圆形细胞数量/细胞总数×100%。

1.5.4β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺、检测

ELISA检测。各组细胞设置标准品孔(含标准品50μL)、待测样本孔(含50μL细胞悬液)和空白对照孔。按照小鼠β-hexosaminidase A、LTC4、histamine的ELISA试剂盒说明书进行检测。

1.6统计方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料多组间采用One-way-ANOAY单因素方差分析，进一步组间比较采用SNK分析。方差不齐者采用Kruskal-Wallis H检验。所有数据以均值±标准差(x¯±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1不同浓度苍耳子含药血清对RBL-2H3细胞活性的影响

见表1。由表1可见，各浓度苍耳子含药血清对RBL-2H3细胞活力均无显著抑制作用，其中10%苍耳子含药血清对RBL-2H3细胞活力影响最小，故后续实验选择10%苍耳子含药血清作为实验给药条件。

表1不同浓度苍耳子含药血清对RBL-2H3细胞活力的影响(x¯±s,%)

2.2苍耳子含药血清对RBL-2H3细胞毒性的影响

见表2。由表2可见，与正常对照组细胞相比，模型对照组肥大细胞的毒性极显著增加(P<0.01);与模型对照组相比，10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞毒性均显著降低(P<0.01)。

表2各组RBL-2H3细胞LDH含量检测结果比较(x¯±s,%)

见图1,表3。

图1各组RBL-2H3细胞甲苯胺蓝染色(×200)

由图1可见，正常对照组细胞呈纺锤梭形状，胞内肝素、组胺和颗粒物质染色后呈紫色；而模型对照组细胞形状呈圆形，胞内紫色颗粒减少；而10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞多呈梭形，胞内紫色颗粒增加。由表3可得，与正常对照组相比，模型对照组细胞脱颗粒率显著增加(P<0.01);与模型对照组相比，10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞脱颗粒率显著降低(P<0.01)。

表3各组RBL-2H3细胞脱颗粒率比较(x¯±s,%)

见表4,图2。由表4、图2可见，与正常对照组相比，模型对照组细胞变形率显著增加(P<0.01);与模型对照组相比，10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞的变形率显著降低(P<0.01)。

表4各组RBL-2H3细胞形态变化比较(x¯±s,%)

2.5苍耳子含药血清对RBL-2H3细胞释放β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺的影响

见表5。由表5可见，与正常对照组相比，模型对照组细胞β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺释放量均极显著增加(P<0.01);与模型对照细胞相比，10%苍耳子含药血清和富马酸酮替芬组细胞β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺释放量显著降低(P<0.01)。

图2各组RBL-2H3细胞RBL-2H3F-actin微丝染色结果(×200)

表5各组RBL-2H3细胞β氨基己糖苷酶A、白三烯C4、组胺释放量比较(x¯±s)

3、讨论

研究显示，苍耳子联合临床AR治疗药物能够更有效地控制患者鼻部症状[8],降低患者体内炎症因子水平[9,10],苍耳子制剂具有良好的减轻AR临床症状潜力。本研究所用的各浓度苍耳子含药血清对肥大细胞活性无明显抑制作用，表明其成分相对安全；而10%苍耳子含药血清能显著降低IgE诱导肥大细胞的细胞毒性。

正常肥大细胞通常呈纺锤形，储有肝素、组胺和颗粒物质[11,12]。本研究F-actin微丝染色结果显示，模型对照组细胞多呈圆形或椭圆形，而10%苍耳子含药血清处理后纺锤形肥大细胞数量显著增加，表明其能够有效稳定致敏肥大细胞形态。此外，甲苯胺蓝染色观察发现，模型对照组细胞形态异常，胞内紫色颗粒显著减少，脱颗粒率显著增加，而10%苍耳子含药血清处理后肥大细胞形态改善，胞内紫色颗粒增加，脱颗粒率显著降低，表明苍耳子含药血清能够抑制IgE致敏肥大细胞脱颗粒，并减少胞内介质释放。

组胺是肥大细胞脱颗粒释放的主要活性物质，其释放量可用于肥大细胞脱颗粒程度的判断[4]。研究表明，苍耳子提取物通过减少肥大细胞Ca2+摄入，增加胞内cAMP含量，以维持肥大细胞膜稳态起到抑制肥大细胞脱颗粒及组胺释放的作用[13]。本研究中IgE致敏肥大细胞的组胺释放量极显著上升，而10%苍耳子含药血清处理后细胞组胺释放量极显著降低，表明其能够抑制过敏肥大细胞释放组胺，抑制脱颗粒程度。本研究还发现，模型对照组细胞的β-hexosaminidase和LTC-4释放量均显著增加，而10%苍耳子含药血清处理后β氨基己糖苷酶A、白三烯C4释放量均显著下降，表明苍耳子含药血清能通过降低过敏肥大细胞脱颗粒程度来减少炎症因子的释放。

综上所述，苍耳子含药血清能够减少组胺、β氨基己糖苷酶A、白三烯C4的释放，并能稳定肥大细胞形态、抑制其脱颗粒过程。

参考文献:

[1]李栋才,王鹏,李胜,等.白藜芦醇调节卵清蛋白诱导的小鼠过敏性鼻炎的作用机制研究[J].中国药理学通报,2021,37(2).215-220.

[4]邹丽,李欣,高金燕,等.I型超敏反应中肥大细胞脱颗粒活性物质及其信号通路研究进展[J].食品安全质量检测学报,2015,6(11):.4532-4537.

[6]王康,孟泳,王玉洁,等.苍耳子治疗过敏性鼻炎的分子机制研究[J].转化医学杂志,2021,10(5):330-334.

[7]余婕,董甜甜,闫梦真,等.天然单体化合物抑制肥大细胞脱颗粒的研究进展[J.中华中医药学刊,2020,38(9):140-142.

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[9]安明丽,马善春.苍耳子鼻炎滴丸联合地塞米松治疗过敏性鼻炎的临床研究[J].现代药物与临床,2019,34(2):509-512.

[10]徐志远,秦永,陈凤义.苍耳子鼻炎滴丸联合氯雷他定治疗过敏性鼻炎临床观察[J].中国药业,2020,29(2):70-72.

基金资助:浙江省温州市科技计划项目(Y20180817);

文章来源:蒋佳欢,鲁晟澄,邵深深.苍耳子含药血清对IgE致敏肥大细胞脱颗粒调控作用的实验研究[J].中国中医药科技,2023,30(04):649-653.