山茱萸(Cornus officinalis)，又称中华山茱萸、山石榴，是杜鹃花目杜鹃花科山茱萸属的植物。它是一种落叶小乔木或灌木，原产于中国、日本和韩国等地。山茱萸通常生长在海拔300～1 500 m的丘陵、山地和山谷地区，喜欢潮湿的环境，常见于山坡林地和河边。

山茱萸在中医药学中有着悠久的历史和广泛的用途。它的果实被称为“山茱萸子”，是一种重要的中药材。山茱萸子富含多种生物活性成分，包括鞣质、黄酮类、多糖、花青素、维生素等，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用。在中医传统中，《本草纲目》中记载了历代医家应用山茱萸的经验，山茱萸子被用来调血脉、滋补肝肾、强健筋骨、益精血等，常用于治疗肝肾亏虚、腰膝酸软、贫血等症状(Hu et al.,2020;Du et al.,2021)。

马钱子苷(loganin,LOG)是山茱萸中的主要环烯醚萜苷类化合物，研究表明马钱素具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗细胞焦亡、抗休克、抗骨质疏松、抗糖尿病、保肝、保护神经、促进周围神经修复、镇静催眠等，并且副作用少(Liu et al.,2020;Wang et al.,2020;Pan et al.,2021)。马钱子苷具有心脏保护作用，其通过减轻心脏纤维化、减少促炎细胞因子分泌抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心脏肥大，此外，马钱子苷对正常细胞和器官没有显著的毒性或副作用(Xu et al.,2021)。Wang等(2022)应用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱和网络药理学研究山茱萸治疗心力衰竭的代谢谱和潜在活性化合物，其中，马钱子苷是山茱萸抗心力衰竭的潜在活性成分。目前，尚无文献报道马钱子苷抗超负荷运动诱导的心肌损伤(OEIMI)的效果。

多项文献证实了马钱子苷对NLRP3炎症体介导的细胞焦亡的抑制作用(Cheng et al.,2020;Cheng et al.,2021;Zhang et al.,2021)。本研究推测，马钱子苷可通过抑制细胞焦亡减轻超负荷运动诱导的心肌损伤。因此，本研究探讨了山茱萸活性成分马钱子苷对超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠的保护作用及其对细胞焦亡的影响。

1、结果与分析

1.1马钱子苷改善心肌损伤大鼠心功能

对比各组大鼠的心功能参数发现(表1)，马钱子苷对心功能有影响(P<0.05)。与NC组相比，OEIMI组的左心室射血分数(LVEF)降低，左室舒张末期内径(LVIDd)和左心室收缩末期内径(LVIDs)升高(P<0.05)。与OEIMI组相比，L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的LVEF呈马钱子苷剂量依赖性增加，LVIDd和LVIDs呈马钱子苷剂量依赖性减少(P<0.05)。与H-LOG组相比，H-LOG+TMAO组的LVEF降低，LVIDd和LVIDs升高(P<0.05)。这表明马钱子苷通过抑制细胞焦亡改善了超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠的心功能。

1.2马钱子苷减轻心肌损伤大鼠心肌损伤

对比各组大鼠的血清心肌损伤指标发现(表2)，马钱子苷对血清心肌损伤指标有影响(P<0.05)。与NC组相比，OEIMI组的血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和心肌肌钙蛋白I(c Tn I)水平升高(P<0.05)。与OEIMI组相比，L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的血清LDH、CK和c Tn I水平呈马钱子苷剂量依赖性降低(P<0.05)。与H-LOG组相比，H-LOG+TMAO组的血清LDH、CK和c Tn I水平升高(P<0.05)。这表明马钱子苷通过抑制细胞焦亡减轻了超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌损伤。

表1马钱子苷对超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心功能参数的影响

表2马钱子苷对超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌损伤指标的影响

1.3马钱子苷改善心肌损伤大鼠血清心肌形态并抑制细胞焦亡

心肌形态方面，HE染色结果显示(图1A),NC组大鼠的心肌形态正常。而OEIMI组显示肌纤维断裂、排列紊乱、肌细胞肿胀变形，且炎性细胞浸润明显。相比之下，L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的心肌组织形态呈马钱子苷剂量依赖性改善。而H-LOG+TMAO组的心肌组织损伤加重。

细胞焦亡方面，TUNEL染色和RT-q PCR检测结果显示(图1;图2)，与NC组相比，OEIMI组的心肌组织TUNEL阳性率和Bax m RNA水平升高，而Bcl-2m RNA水平降低(P<0.05)。与OEIMI组相比，L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的心肌组织TUNEL阳性率和Bax m RNA水平呈马钱子苷剂量依赖性降低，而Bcl-2 m RNA水平呈马钱子苷剂量依赖性升高(P<0.05)。与H-LOG组相比，H-LOG+TMAO组的心肌组织TUNEL阳性率和Bax m RNA水平升高，而Bcl-2m RNA水平降低(P<0.05)。这表明马钱子苷通过抑制细胞焦亡改善超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠的心肌形态并抑制细胞焦亡。

1.4马钱子苷抑制心肌损伤大鼠心肌组织氧化应激

马钱子苷影响了各组大鼠的心肌组织抗氧化能力(P<0.05)(表3)。与NC组比较，OEIMI组的心肌组织SOD和CAT活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。与OEIMI组比较，L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的心肌组织SOD和CAT活性呈马钱子苷剂量依赖性升高，MDA含量呈马钱子苷剂量依赖性降低(P<0.05)。与H-LOG组比较，H-LOG+TMAO组心肌组织SOD和CAT活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。提示马钱子苷通过抑制细胞焦亡抑制超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌组织氧化应激。

1.5马钱子苷对心肌损伤大鼠心肌组织细胞焦亡相关蛋白表达的影响

心肌组织抗氧化能力方面，马钱子苷影响了各组大鼠的心肌组织抗氧化能力(P<0.05)(表3)。与NC组比较，OEIMI组的心肌组织SOD和CAT活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。与OEIMI组比较，L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的心肌组织SOD和CAT活性呈马钱子苷剂量依赖性升高，MDA含量呈马钱子苷剂量依赖性降低(P<0.05)。与H-LOG组比较，H-LOG+TMAO组的心肌组织SOD和CAT活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。这提示马钱子苷通过抑制细胞焦亡抑制超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌组织氧化应激。

表3马钱子苷对超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌组织氧化应激指标的影响

2、讨论

超负荷运动引起的心肌损伤在运动员、体力劳动者和健身人群中较为常见，因此预防和治疗该类型心肌损伤具有重要意义(Xu et al.,2021)。本研究旨在探讨马钱子苷对超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠的保护作用，并对其机制进行研究。

研究结果表明，马钱子苷对超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠的心功能有明显改善作用。心功能参数如左心室射血分数(LVEF)的升高和左室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)的降低，显示马钱子苷的治疗剂量依赖性。这表明马钱子苷能有效地减轻超负荷运动诱导的心肌损伤对心功能的影响。

超负荷运动过程中，氧自由基(ROS)的过量产生会导致氧化应激损伤(Loboda et al.,2016)。而马钱子苷作为一种天然产物，具有明显的抗氧化活性，能够抑制ROS的产生并增加抗氧化酶活性(Park et al.,2022)。本研究结果显示，马钱子苷减少了超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌组织中丙二醛(MDA)的含量，同时增加了超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。这表明马钱子苷通过其抗氧化活性减轻了心肌组织的氧化应激损伤。

细胞焦亡在心肌损伤过程中也起到了重要作用(Wan et al.,2017;Park et al.,2022)。本研究发现，超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌组织的细胞焦亡率明显增加，而马钱子苷可剂量依赖性地抑制心肌细胞焦亡。此外，马钱子苷能够调节细胞焦亡相关基因Bax和Bcl-2的表达水平，进一步证实其抗焦亡作用。

细胞焦亡是一种新型的细胞死亡形式，与NLRP3炎症体的激活有关。NLRP3炎症体的激活会导致IL-1β和IL-18的成熟和释放，引起心肌炎症和细胞焦亡(Li et al.,2020)。马钱子苷在多种疾病中已被证实能够抑制NLRP3炎症体的激活，从而减轻炎症反应和细胞焦亡(Toldo and Abbate,2018;Lammert et al.,2020)。本研究结果显示，马钱子苷通过抑制NLRP3炎症体的激活，减少了超负荷运动诱导的心肌损伤大鼠心肌组织中相关蛋白的表达，包括NLRP3、cleaved caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18。这表明马钱子苷通过抑制NLRP3炎症体的激活来减轻心肌细胞的焦亡。

最后，通过同时给予细胞焦亡诱导剂TMAO，研究结果显示TMAO减弱了马钱子苷对心肌组织细胞焦亡的抑制作用，并减弱了其心脏保护作用。这进一步证实了马钱子苷通过抑制细胞焦亡减轻超负荷运动诱导的心肌损伤。

综上所述，本研究结果表明，马钱子苷具有抑制细胞焦亡和减轻超负荷运动诱导的心肌损伤的潜在价值。马钱子苷可能是一种天然药物，可作为防治超负荷运动诱导的心肌损伤的潜在药物，为运动员和健身人群提供心脏保护和健康支持。然而，尽管马钱子苷在本研究中显示出明显的心脏保护作用，但其具体机制仍需进一步深入研究和探讨。同时，临床试验也是必要的，以验证其在人体中的效果和安全性。希望本研究能为进一步探索马钱子苷的应用提供新的思路和依据。

3、材料与方法

3.1实验动物及模型建立

在本实验中，我们从上海灵畅生物科技有限公司购买了8周龄(体重260～320 g) SPF级雄性SD大鼠用于实验[生产许可SCXK(沪)2023-0003]，并在屏障环境中饲养这些大鼠。

本研究采用递增负荷游泳来诱导超负荷运动引发心肌损伤大鼠模型。NC组大鼠被保持安静饲养，而其他组大鼠则进行递增负荷游泳。在灌胃马钱子苷后的2 h内进行递增负荷游泳运动，实验所用水槽尺寸为50 cm×50 cm×40 cm，水深为50 cm，水温保持在30℃。游泳方案如下：第1～3周进行无负重游泳，初始游泳时间为5 min，每天递增5 min，第4～6周进行递增负重游泳，将5%体重的铅坠分别系于大鼠尾根部，第4、5、6周负重分别为1%、3%、5%体重，游泳时间固定为120 min。每周进行游泳6 d，共进行6周。

3.2实验动物分组和处理

在本研究中，将大鼠分为以下六组：NC组、OEI-MI组、L-LOG组、M-LOG组、H-LOG组和H-LOG+TMAO组，每组大鼠数量为20只。

NC组和OEIMI组的大鼠将被灌胃2 m L 1%DMSO。L-LOG组、M-LOG组和H-LOG组的大鼠分别将被灌胃2 m L 50、100和200 mg·kg-1·d-1的马钱子苷溶液(溶于1%DMSO)。H-LOG+TMAO组的大鼠将被灌胃2 m L 40 mg·kg-1·d-1的马钱子苷溶液，并在此基础上将TMAO以1.5%的浓度溶解在水中供大鼠饮用，参考了文献中的方法(Li et al.,2018)。所有给药将持续进行6周。马钱子苷的给药剂量参考了文献中的建议(Xu et al.,2021)。马钱子苷(HY-N0512,纯度:99.82%)和细胞焦亡诱导剂TMAO (HY-116084)由美国MCE公司提供。

3.3相关参数和指标测定

心功能参数测定：使用VEVO 3100超高分辨率小动物超声成像系统(美国Visual Sonics公司)对心功能参数进行检测，包括左心室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVIDd)和左心室收缩末期内径(LVIDs)。

血清心肌损伤指标测定：使用异氟醚麻醉大鼠后，固定四肢，皮肤消毒，剃毛，剪开腹腔，暴露腹主动脉，进行无菌采血，获得1 m L血清。按照试剂盒说明书，通过比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)，通过增强免疫比浊法检测心肌肌钙蛋白I (c Tn I)。

心肌组织氧化应激指标测定：将心肌组织剪碎，研磨匀浆，离心取上清。采用巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)，采用NBT法检测超氧化物歧化酶(SOD)，采用紫外分光光度计法检测过氧化氢酶(CAT)。

组织学染色：麻醉并处死大鼠，无菌分离心脏，用PBS清洗后制作心肌石蜡切片。按照制造商的说明书，对心肌切片进行HE染色和TUNEL染色，然后在BX63共聚焦显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察切片。

3.4 RT-q PCR分析

使用RNAiso Plus试剂提取心肌细胞总RNA，然后使用逆转录试剂盒将RNA逆转录成c DNA。接着在i Q5实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)上使用SYBR®Premix Ex TaqTMII (Tli RNase H Plus)进行扩增。引物序列如下：Bax:F:5'-TTTGTTACAGGGT TTCATCCAGG-3',R:5'-TTCCAGATGGTGAGCGA GGC-3';Bcl-2:F:5'-GGCATCTTCTC CTTCCAG-3',R:5'-CATCCCAGCCTCCGTTAT-3';GAPDH:F:5'-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3',R:5'-TGAGGTC AATGAAGGGGTC-3'。使用GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达水平。

3.5 Western blot实验

使用RIPA缓冲液提取心肌组织的总蛋白，然后将等量的蛋白加载到10%SDS-PAGE中进行分离，之后转移到PVDF膜上。将膜用5%脱脂牛奶进行封闭1.5 h，随后与NLRP3、cleaved caspase-11、ASC、IL-1β、IL-118和GAPDH一抗(1:1 000稀释)在4℃下孵育过夜。第二天与Ig G H&L (HRP)二抗(1:1 000稀释)室温孵育2 h，然后使用ECL显色。GAPDH被用作蛋白质的内参。使用Image Lab软件进行灰度分析。

3.6数据统计分析

使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析和LSD事后检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

作者贡献

傅超是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，并完成数据分析、论文初稿的写作与修改。作者已阅读并同意最终的文本。

文章来源:傅超.山茱萸活性成分马钱子苷对超负荷运动大鼠心肌细胞焦亡的保护作用[J].分子植物育种,2023,21(20):6894-6900.