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岩藻多糖对系统性红斑狼疮小鼠肾损伤的影响

2024-01-02 86 上传者：管理员

摘要：目的研究岩藻多糖对系统性红斑狼疮(SLE)小鼠肾损伤的保护作用及其作用机制。方法将雌性MRL/lpr小鼠随机分为模型组、阳性对照组、低剂量实验组、高剂量实验组，每组10只，另选10只雌性MRL/MpJ小鼠作为对照组；其中低、高剂量实验组小鼠分别每天灌胃给予150、300 mg·kg-1岩藻多糖，阳性对照组小鼠每天灌胃给予5 mg·kg-1泼尼松，对照组和模型组小鼠每天灌胃给予等量的0.9%NaCl。给药4周后采集血液和胸腺、脾、肾器官组织保存备用。以苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠肾组织病理学变化；以试剂盒检测血清尿素氮(BUN)、血清肌酸酐(Scr)水平和血清炎症因子水平；以免疫组化法和蛋白质印迹(Western blot)法检测肾组织Nod样受体蛋白3(NLRP3)和胱天蛋白酶-1(caspase-1)表达水平。结果对照组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组、阳性对照组小鼠脾指数分别为4.56±0.24、2.41±0.38、2.91±0.23、3.70±0.35和3.12±0.51;BUN水平分别为(4.02±0.57)、(11.26±1.60)、(9.38±0.63)、(7.73±0.42)和(7.09±0.70)mmol·L-1;白细胞介素-18(IL-18)水平分别为(15.11±1.60)、(62.45±7.45)、(42.64±5.76)、(23.88±2.96)和(30.65±2.77)ng·L-1;以上指标，模型组与对照组比较，低剂量实验组、高剂量实验组、阳性对照组分别与模型组比较，高剂量实验组与低剂量实验组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论岩藻多糖可改善SLE小鼠肾组织病理学变化，调节免疫功能，控制炎症进而提高肾功能，这可能与抑制NLRP3炎性小体有关。

关键词：
Nod样受体蛋白3炎性小体
岩藻多糖
炎症反应
统性红斑狼疮
肾损伤
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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种影响多器官系统的慢性自身免疫性疾病，SLE最常见且较为严重的临床症状之一是肾损伤[1]。有报道称SLE与免疫耐受缺陷介导的炎症反应有关，包括自身抗体产生过多、慢性炎症和器官损伤[2]。糖皮质激素和免疫抑制药治疗SLE虽然有显著疗效，但其药物不良反应也不容忽视，如代谢紊乱、感染和戒断反应等[3]。岩藻多糖是一类含有硫酸基团和岩藻糖的多糖，在免疫调节中发挥重要作用[4]。MRL/lpr小鼠是由LG、C3H、AKR、C57BL/6几种不同品系小鼠经过一系列杂交至第12代获得的，可随着日龄的增长出现近似于人狼疮样表型，是一种很好的SLE模型，且常用MRL/MpJ小鼠作为MRL/lpr小鼠对照。本研究以MRL/lpr小鼠为SLE模型，探讨岩藻多糖对SLE小鼠肾损伤的治疗作用及其可能的作用机制。

一、材料与方法

1 材料

动物

6～7周龄SPF级别的雌性MRL/lpr小鼠及雌性MRL/MpJ小鼠，体质量21～23 g, 购自郑州大学(河南省实验动物中心)。动物生产许可证号：SCXK(豫)2022-0001。本研究经濮阳医学高等专科学校伦理委员会批准(20220630)。

药品与试剂

岩藻多糖，规格：每瓶25 g, 纯度：95%,批号：20220810,购自上海沪峥生物科技有限公司；醋酸泼尼松片，规格：每片5 mg, 批号：20221101,批准文号：国药准字H53020062,云南白药集团股份有限公司生产。苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色液，武汉卡诺斯科技有限公司生产；小鼠尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，上海白益生物科技有限公司生产；小鼠血清肌酸酐(serum creatinine, Scr)ELISA试剂盒，上海化邦生物科技有限公司生产；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),上海雅吉生物科技有限公司生产；肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)试剂盒、IL-1试剂盒、IL-18试剂盒，均由上海酶联生物科技有限公司生产；枸橼酸盐缓冲液，购自上海联祖生物科技有限公司；二氨基联苯胺辣根过氧化物酶显色试剂盒，上海沪震实业有限公司生产；Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3, NLRP3)抗体、胱天蛋白酶-1(cysteine aspartate proteinase 1,caspase-1)抗体、β肌动蛋白(β-actin)抗体，均购自英国Abcam公司；羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗，购自北京博尔西科技有限公司。

仪器

xMark酶标仪，美国伯乐公司产品；DMi1倒置显微镜，德国徕卡公司产品。

2 实验方法

2.1 动物分组与处理

所有动物均饲养于SPF条件下，恒温25 ℃,光照/黑暗循环12 h, 湿度40%～60%。所有小鼠适应性饲养1周后，将10只雌性MRL/MpJ小鼠作为对照组，MRL/lpr小鼠随机分为模型组、低剂量实验组、高剂量实验组、阳性对照组，每组10只小鼠。低、高剂量实验组小鼠分别每天灌胃给予150、300 mg·kg-1岩藻多糖(剂量根据半数致死剂量和预实验确定),阳性对照组小鼠每天灌胃给予5 mg·kg-1泼尼松，对照组和模型组小鼠每天灌胃给予等量的0.9%NaCl。给药4周，处理结束后采集血液，并处死小鼠收集胸腺、脾、肾器官组织保存备用。

2.2 以HE染色法检测小鼠肾组织病理学变化[5]5]

取各组小鼠肾组织，用4%的多聚甲醛进行固定24 h, 然后使用流水冲洗后进行常规梯度脱水和包埋制成5 μm切片。切片脱蜡至水，然后用二甲苯浸泡切片，脱水后进行HE染色后封片，用显微镜进行观察，对肾小管、肾小管间质及肾小球组织进行病理评分。

2.3 各组小鼠免疫器官指数计算[6]6]

取各组治疗结束后小鼠，称取小鼠体质量后处死，并收集小鼠胸腺和脾组织，称量并记录，计算胸腺指数和脾指数。胸腺(脾)指数=胸腺(脾)质量(mg)/总体质量(g)。

2.4 以ELISA法检测血清BUN、Scr水平和炎症指标水平[7]7]

各组小鼠采血后在室温下静置20 min后，在4 ℃下以3 000 r·min-1离心20 min(离心半径：10 cm),收集上清液(若保存中出现沉淀，应再次离心),然后按照试剂盒具体操作步骤检测BUN、Scr水平。

各组小鼠采血后在室温下静置2 h后，在4 ℃下以3 000 r·min-1离心20 min(离心半径：10 cm),收集上清液，然后严格按照试剂盒操作步骤检测血清炎症指标IL-6、TNF-α、IL-1、IL-18水平。

2.5 以免疫组化法检测肾组织NLRP3表达

取各组小鼠肾组织石蜡切片，脱蜡至水后用0.01 mol·L-1枸橼酸盐缓冲液浸泡进行抗原修复，20 min后用磷酸盐缓冲液清洗，滴加NLRP3一抗，37 ℃下孵育120 min, 并在4 ℃下过夜，按文献[8]方法操作，然后用显微镜观察，棕黄色或黄色为阳性染色。

2.6 以蛋白质印迹(Western blot)法检测肾组织NLRP3和caspase-1表达水平[9]9]

使用裂解液裂解各组小鼠肾组织提取总蛋白，用二喹啉甲酸法对总蛋白进行定量，然后取适量蛋白品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，结束后转至聚偏二氟乙烯膜，并将膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h。然后加入NLRP3(1∶1 000)、caspase-1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗试剂4 ℃下孵育过夜，次日清洗后加入二抗稀释液(1∶2 000)孵育2 h(37 ℃),TBST清洗后电化学发光显色、曝光，并进行灰度值分析。

3 统计学处理

用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计量资料用

表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 岩藻多糖对SLE小鼠肾组织病理学评分的影响

低、高剂量实验组小鼠分别每天灌胃给予150、300 mg·kg-1岩藻多糖，阳性对照组小鼠每天灌胃给予5 mg·kg-1泼尼松，对照组和模型组小鼠每天灌胃给予等量的0.9%NaCl。

与对照组比较，模型组小鼠肾小管、肾小管间质及肾小球评分均显著增加(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组和阳性对照组肾小管、肾小管间质及肾小球评分均显著降低(均P<0.05);高剂量实验组的肾小管、肾小管间质及肾小球评分较低剂量组均显著进一步降低(均P<0.05),见表1。

2 岩藻多糖对SLE小鼠免疫器官指数的影响

与对照组比较，模型组小鼠脾质量、胸腺质量及脾指数、胸腺指数均显著降低(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组和阳性对照组脾质量、胸腺质量及脾指数、胸腺指数均显著上升(均P<0.05);高剂量实验组的脾质量、胸腺质量及脾指数、胸腺指数较低剂量实验组均显著进一步提高(均P<0.05),见表2。

表1 各组小鼠肾组织病理学评分的比较

表2 各组小鼠免疫器官指数的比较

表3 各组小鼠血清BUN和Scr水平的比较

3 岩藻多糖对SLE小鼠肾功能指标的影响

与对照组比较，模型组小鼠BUN、Scr水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组和阳性对照组BUN、Scr水平均显著下降(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组小鼠BUN、Scr水平均进一步降低(均P<0.05),见表3。

4 岩藻多糖对SLE小鼠血清炎症指标的影响

与对照组比较，模型组小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1、IL-18水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组和阳性对照组血清IL-6、TNF-α、IL-1、IL-18水平均显著降低(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1、IL-18水平均显著下降(均P<0.05),见表4。

5 岩藻多糖对NLRP3炎症小体表达的影响

与对照组比较，模型组NLRP3和caspase-1蛋白表达水平均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组和阳性对照组NLRP3和caspase-1蛋白表达水平均明显下降(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组小鼠NLRP3和caspase-1蛋白表达水平均显著降低(均P<0.05),见图1和表5。

表4 各组小鼠血清炎症相关指标比较

d with model group, #P<0.05; Compared with low dose experimental group, &P<0.05.

表5 各组小鼠肾组织NLRP3、caspase-1蛋白表达水平的比较

图1 以蛋白质印迹法检测小鼠肾组织NLRP3和caspase-1表达情况

三、讨论

岩藻多糖又名藻糖胶、褐藻多糖等，其主要存在于褐藻类生物中的天然活性硫酸盐多糖，岩藻多糖由于其具有多种生物学功能的特点，已被广泛应用于美容化妆品、功能食品、生物医用等多个领域[10]。本研究中，HE染色结果发现岩藻多糖治疗后，SLE小鼠肾组织病理学变化得到改善，此外本研究还发现岩藻多糖治疗后，SLE小鼠血清BUN、Scr水平均显著降低，BUN、Scr是临床上常用于反映肾功能的关键指标，本研究的结果表明岩藻多糖可显著改善SLE肾损伤，提高肾功能。

研究已经证实，岩藻多糖具有显著的免疫调节作用，可通过增强免疫器官，调整机体免疫系统功能，进而提高免疫活力[4,11]。哺乳动物外周免疫系统抗体产生的主要器官有胸腺和脾，且胸腺和脾是抗原抗体反应的关键场所[12]。本研究发现，经岩藻多糖治疗后，小鼠脾质量和脾指数及胸腺质量和胸腺指数均较模型组显著增加，这表明岩藻多糖可通过调节SLE小鼠胸腺和脾指数介导免疫功能。

本研究中，岩藻多糖治疗后，SLE小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1、IL-18水平均呈剂量依赖性显著降低，这提示岩藻多糖可抑制促炎因子的表达控制炎症反应。进一步探究岩藻多糖作用于SLE小鼠的作用机制，本研究发现岩藻多糖治疗后，SLE小鼠肾组织NLRP3和caspase-1表达水平均显著降低。本研究结果提示，岩藻多糖可能是通过抑制NLRP3的表达降低促炎因子的释放进而改善SLE小鼠肾功能。

岩藻多糖可能介导NLRP3炎症小体，抑制炎症反应，调节免疫功能改善SLE小鼠肾损伤。

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