人的睡眠觉醒节律与自然界相应，“昼精夜瞑”是正常的睡眠觉醒节律状态，即白天精力旺盛，夜晚沉睡安眠。失眠患者出现睡眠时间不足和（或）质量不高，日间疲劳及社会功能低下表现。我们前期基于“昼精夜瞑”理论辨治失眠病[1]，临床应用调和气血和育阴潜阳法治疗失眠能够取得较好疗效，组方益神宁心方能够恢复患者机体内稳态平衡，达到“昼精夜瞑”状态，同时改善失眠患者伴随的焦虑情绪[2,3]。作为一种相对简单的脊椎动物，斑马鱼在生理上与人类同源，睡眠觉醒节律与人类相似，在睡眠药理药效学研究中的应用逐渐增多[4]。γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺（5-HT）和褪黑素（MT）都是在中枢神经表达的关键神经递质，与睡眠、焦虑密切相关[5]。因此，本研究应用咖啡因诱导斑马鱼睡眠剥夺模型，评价益神宁心方对斑马鱼行为学以及体内GABA、5-HT、MT含量和相关基因水平变化的影响，现将有关结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

采用野生型AB系斑马鱼，购自中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心，饲养于上海交通大学医学院附属新华医院斑马鱼研究平台，饲养、繁殖均在平台完成，实验选用受精后5 d(5 dpf）的幼鱼。饲养条件：鱼房温度为（28.5±1）℃，光暗条件为14 h∶10 h循环交替，养鱼水pH值为7.0～8.0。此时期斑马鱼可从自身卵黄囊中获取营养，不需喂食。

1.1.2 药物与试剂

咖啡因，美国Sigma公司（批号：BCCC8969);MT，北京索莱宝科技有限公司（批号：728Q024);GABA、5-HT和MT酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒，上海信裕生物科技有限公司（批号：XYE33451、XYE33402、XYE33420）。

益神宁心方（黄芪、麦冬、黄连、肉桂、生牡蛎、地龙等），按照相关专利保护要求形成固定制剂（专利号：ZL2022114335310）。单味中药由上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科提供，称取相应中药饮片，以饮片质量10倍量的水浸泡2 h，武火煮沸后转文火煎煮30 min，取药液；再加8倍量水武火煮沸后转文火煎煮30 min，取药液；将两次药液合并，浓缩至浓度为1.0 g/mL（以生药量计），高温高压灭菌，4℃备用。益神宁心方中活性成分如黄芪多糖用高效液相色谱（HPLC）法监测，与对照品黄芪多糖（中国药品生物制品检定所生产）对比，以保证研究制剂的稳定性。

1.1.3 主要仪器

斑马鱼行为轨迹跟踪系统，荷兰Noldus公司（型号：Danio Vision）；实时荧光定量PCR仪，力康生物医疗科技有限公司（型号：CG-05）；低温高速离心机，美国Beckman公司（型号：B37913）；酶标仪器，美国ThermoFisherScientific公司（型号：MK3117123001）；分析天平，德国Sartorius公司（型号：910324）。

1.2 分组

选取5 dpf野生型AB系斑马鱼，在显微镜下挑选发育正常的斑马鱼，随机分为6组，分别为正常组、模型组、褪黑素组及益神宁心方低、中、高剂量组。

1.3 造模与干预

1.3.1 药物的最大耐受浓度（MTC)

药物的MTC是药物不引起实验动物死亡的最大剂量。随机选取140条5 dpf斑马鱼置于6孔板中，按不同的浓度各分为7组，每组20只。根据参考文献[6]，将益神宁心方的浓度初步设定为25、50、100、250、500、1 000和2 000 mg/L，每孔加入3 mL，持续暴露24 h，观察斑马鱼的反应情况，并统计各实验组的死亡数量与死亡率。根据初步浓度结果进一步细化后再次进行实验，最后统计所得结果计算浓度效应，最后确定中药的MTC。

1.3.2 最佳咖啡因造模剂量

应用200、250、300、350及400μmol/L 5组不同浓度咖啡因作用斑马鱼1 h后，定量分析其行为学改变1 h，检测5组斑马鱼运动距离、运动时间、静息时间及大、中、小运动时间。每组12条。

1.3.3 造模及干预方法

正常组：正常饲养，未处理；模型组：应用咖啡因水溶给药处理斑马鱼24 h；益神宁心方各组：根据相关文献[6]，选取中药MTC、1/3MTC和1/9MTC分别设为益神宁心方高剂量组、中剂量组和低剂量组，在模型组基础上，用中药水溶给药处理斑马鱼24h；褪黑素组：根据课题组前期实验结果确定10μmol/L褪黑素为最低有效剂量，在模型组基础上，用此浓度褪黑素水溶给药处理斑马鱼24 h。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 检测自主活动

使用EthoVison-XT软件记录并评估斑马鱼的运动行为，设置速度<4 mm/s为小运动，速度4～20 mm/s为中运动，速度>20 mm/s为大运动。在对5 dpf斑马鱼持续24 h给药过程中，对各组给药后5 h斑马鱼幼鱼进行黑暗状态下连续1 h(3 600 s）的自发行为记录，记录各组斑马鱼的运动时间、运动距离、静息时间和3种运动形式的运动时间。每组12条。

1.4.2 检测趋触性

趋触性是指斑马鱼在一个新的环境中，是否会自发接近容器边缘地带的特性，反映斑马鱼焦虑水平。1 h行为学检测结束后，将各组斑马鱼幼鱼转移至24孔板中，每孔中一条幼鱼、2 mL溶液，孔的内径为15.88 mm，幼鱼可自由活动（见图1）。参考相关文献[7]，将24孔板每孔分为中心区和外周区两个观察区，中心区面积为整孔面积的一半。斑马鱼幼鱼首先在行为观察仪系统中适应5 min的黑暗环境，然后在15 min明暗交替（黑暗5 min、光照5 min、黑暗5 min交替）的条件下进行实验，连续测定斑马鱼的趋触性行为15 min。统计斑马鱼在两个区域游动的距离和时间，其中以中心区域累积运动占全区域的距离百分比及时间百分比为指标表征斑马鱼的趋触性。

图1 斑马鱼趋触性观察   

1.4.3 检测GABA、5-HT和MT含量

用药24 h后收集各组幼鱼，每组60条置于2 mL的EP管中，每组3个重复，根据ELISA试剂盒操作说明书检测各指标浓度。

1.4.4 检测GABA、5-HT和MT系统相关基因表达量

采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测γ-氨基丁酸A型受体a1亚单位基因（gabra1）、γ-氨基丁酸A型受体γ2亚单位基因（gabrg2）、5-羟色胺受体1A类亚型基因（htr1aa）、5-羟色胺受体1D类亚型基因（htr1bd）、褪黑素受体1A类亚型基因（mtnr1aa）、褪黑素受体1B类亚型基因（mtnr1ba）的表达。5 dpf斑马鱼持续给药24 h后收集各组幼鱼（每组30条），每组随机平均分为3份样本，加入TRIzol提取总mRNA并逆转录为cDNA。反应条件：预变性94℃，2 min；变性94℃，15 s；退火60℃，15 s；延伸60℃，30 s；循环40次。以β-肌动蛋白基因（β-actin）为内参基因，mRNA的相对表达量根据2-ΔΔCt法计算。所有引物由捷瑞生物工程（上海）有限公司合成，引物序列见表1。  

表1 引物序列  

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0软件对实验数据进行统计分析及作图。数据采用表示，分别使用Shapiro-Wilk检验和Levene检验分析原始数据方差的正态性和同质性，通过单因素方差分析和Tukey检验对数据进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 药物的最大耐受浓度（MTC)

益神宁心方设置的浓度分别为25、50、100、250、500、1 000和2 000 mg/L共7组。其中1 000 mg/L和2 000 mg/L浓度下斑马鱼死亡数分别为1只、10只，死亡率分别为5%和50%，其余浓度无死亡。再进一步细化浓度，分为900、800、700、600、500 mg/L共5组，结果900 mg/L浓度及以下全部存活。统计所得结果，最后确定益神宁心方MTC为900 mg/L。在接下来的实验中，将MTC设为高剂量组，1/3 MTC(300 mg/L）设为中剂量组，1/9 MTC(100 mg/L）设为低剂量组。

2.2 咖啡因最佳造模浓度

5 dpf斑马鱼进行1 h不同浓度咖啡因浸泡后，对斑马鱼幼鱼运动行为进行连续较，300μmol/L咖啡因组斑马鱼运动距离、运动时间显著增加，静息时间显著减少，差异有统计学意义（P<0.05），表现出更加活跃的状态，故咖啡因造模浓度选用300μmol/L。见图2。1 h(3 600 s）的自发行为记录。结果显示，与正常组比

图2 不同浓度咖啡因对斑马鱼行为学的影响  

2.3 对自主活动的影响

与正常组比较，模型组斑马鱼黑暗状态下运动状态覆盖距离及持续时间均显著增加，中运动时间显著增加，静息状态覆盖时间显著减少，差异有统计学意义（P<0.05），提示造模成功。与模型组比较，褪黑素组和益神宁心方中、高剂量组药物干预均能减少运动距离（P<0.05）、减少运动时间（P<0.05）、减少中运动时间（P<0.05）、增加静息时间（P<0.05），其中益神宁心方高剂量组诸项指标均效果最佳（P<0.05）。与褪黑素组比较，益神宁心方低、中剂量组运动距离、运动时间、中运动时间显著增加，静息时间显著减少，差异有统计学意义（P<0.05），益神宁心方高剂量组各指标差异均无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方低剂量组比较，益神宁心方高、中剂量组运动距离、运动时间、中运动时间显著减少，静息时间显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与益神宁心方中剂量组比较，益神宁心方高剂量组运动距离、运动时间显著减少，静息时间显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

2.4 对趋触性的影响

与正常组比较，模型组中心区域时间百分比和中心区域距离百分比显著减少，差异有统计学意义（P<0.05），提示模型组斑马鱼趋触性行为增加。与模型组比较，益神宁心方高剂量组中心区域时间百分比和中心区域距离百分比显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），益神宁心方低、中剂量组各项指标均差异无统计意义（P>0.05）。与褪黑素组比较，中药低、中、高剂量组各指标差异均无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方低剂量组比较，益神宁心方高剂量组中心区域时间百分比显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）；益神宁心方中剂量组诸项指标差异均无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方中剂量组比较，益神宁心方高剂量组中心区域时间百分比显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

图3 各组斑马鱼行为学比较   

2.5 对GABA、5-HT和MT含量的影响

与正常组比较，模型组及益神宁心方低、中剂量组GABA、MT含量显著减少，5-HT含量显著增加，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，益神宁心方高剂量组GABA、MT含量显著升高，5-HT含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；益神宁心方中剂量组5-HT含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；益神宁心方低剂量组各指标差异均无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方低剂量组比较，益神宁心方高剂量组GABA、MT含量显著升高，5-HT含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；益神宁心方中剂量组各项指标差异均无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方中剂量组比较，益神宁心方高剂量组GABA、MT含量显著升高，5-HT含量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

图4 各组斑马鱼趋触性比较   

2.6 对gabra1、gabrg2、htr1aa、htr1bd、mtnr1aa、mtnr1ba mRNA相对表达水平的影响

与正常组比较，模型组gabra1、gabrg2、mtnr1aa、mtnr1ba mRNA相对表达水平显著降低，htr1aa和htr1bd mRNA相对表达水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，益神宁心方高剂量组gabra1、mtnr1aa、mtnr1ba mRNA相对表达量显著升高，htr1aa mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；益神宁心方中剂量组gabrg2、mtnr1ba mRNA相对表达量升高，htr1bd mRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；益神宁心方低剂量组各项指标差异无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方低剂量组比较，益神宁心方中剂量组htr1bd mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），其余指标差异均无统计学意义（P>0.05）；益神宁心方高剂量组各项指标差异无统计学意义（P>0.05）。与益神宁心方中剂量组比较，益神宁心方高剂量组各项指标差异均无统计学意义（P>0.05）。见图6。

图5 各组斑马鱼神经递质含量比较   

3、讨论

失眠归属中医学“不寐”范畴，病因在于阴阳失衡、气血失常，以致睡眠觉醒节律紊乱，出现卫气白昼出营阴不利的“昼不精”、卫气夜晚入营阴不利的“夜不瞑”等病理现象。临床治疗失眠重在调理气血、平衡阴阳，以恢复患者的“昼精夜瞑”状态。“昼精夜瞑”是课题组治疗不寐的共同目标，目前已开展的动物实验研究显示，中药干预动物“昼精夜瞑”现象的结果和临床疗效相一致。应用调和气血、补益气血法提高日间精神和育阴潜阳、水火相济法促进夜间入睡，可以恢复患者“昼精夜瞑”状态[1]。益神宁心方是张振贤教授治疗失眠的经验方，核心药物黄芪甘温益气，养元神、滋五脏，为君。麦冬“补心气之劳伤……益精强阴”，为臣。佐以地龙定惊通络、缓烦懊、安心神，兼活血化瘀；牡蛎镇心安神、滋阴潜阳；黄连除烦，可治阴血不足致心火虚亢之候；肉桂助阳暖水脏、鼓动气血生长。课题组前期研究[2,3]应用益神宁心方治疗失眠，结果显示，益神宁心方具有改善失眠患者睡眠情况及伴随焦虑、抑郁等负面情绪作用，同时对褪黑素等激素水平有较好的昼夜节律调控作用。

目前针对睡眠机制的研究主要依靠动物进行，斑马鱼相比于啮齿类动物具有与人类基因同源性高、与人类慢波睡眠和快速眼动睡眠相似的优势，目前越来越多地应用于睡眠领域研究[4]。睡眠剥夺（SD）是一种造成动物失眠的有效方式，咖啡因是制造动物失眠模型的常用药物之一，通过结合大脑神经中的腺苷受体抑制睡眠，增强觉醒[8]。相关研究[9,10]发现，咖啡因处理后的斑马鱼幼体，出现运动状态持续时间及大运动覆盖距离增加，静息状态持续时间及覆盖距离减少，与失眠的临床特征相似。本实验研究行为学结果与上述研究结果一致，在300μmol/L咖啡因浓度时，斑马鱼失眠模型复制成功。益神宁心方能通过减少咖啡因造模后斑马鱼失眠模型的运动距离、运动时间及增加静息时间来改善斑马鱼的睡眠剥夺状态，并随着浓度升高其相关作用更明显。褪黑激素作为阳性对照药，可显著改善模型组斑马鱼的运动时间和运动距离，与益神宁心方高剂量组疗效相仿。

图6 各组斑马鱼相关基因相对表达水平比较   

趋触行为可反映斑马鱼的焦虑行为，光照-黑暗交替的视觉反应测试可以引起斑马鱼幼鱼的超运动行为，在光照-黑暗转变期间斑马鱼幼鱼趋触性行为增加，反映出这种外来的环境刺激增加了斑马鱼幼鱼的焦虑水平[11]。同时，咖啡因可诱发斑马鱼的焦虑样反应，并和剂量、集体环境相关[12,13]。本研究结果表明，明暗刺激下咖啡因模型组中心区域时间百分比和中心区域距离百分比减少，提示斑马鱼趋触性行为增加，符合斑马鱼焦虑行为的特征。临床中失眠伴焦虑患者占20%～30%[14]，利用咖啡因诱导的斑马鱼行为学改变及焦虑样行为很好地模拟了部分失眠患者在日间的焦虑和躁动不安的精神状态，符合临床实际。益神宁心方大剂量组斑马鱼趋触性行为与模型组对比减少，与褪黑素组相比有减少趋势，其他浓度组斑马鱼趋触性行为也有减少趋势，提示益神宁心方可以降低斑马鱼幼鱼在15 min明暗交替刺激下咖啡因造模时的焦虑程度。

在咖啡因造模中，我们关注到GABA、5-HT和MT等神经递质及其受体的变化。GABA是一种存在于中枢神经系统的抑制性神经递质[15]，斑马鱼的镇静和运动是GABAA受体α1亚单位介导的[16]，主要由gabra1基因编码。斑马鱼的焦虑行为可能与gabrg2编码的GABAA受体γ2亚基减少有关[17]。gabra1和gabrg2的上调可以抑制斑马鱼的压力或焦虑相关行为[18]。5-HT是睡眠-觉醒周期中重要的神经递质，与焦虑密切相关[19]。在斑马鱼中，htr1aa及htr1bd基因编码的5-HT1两个亚组（5-HT1A和5-HT1D受体）与焦虑行为相关[20,21]。MT是一种调节昼夜节律的激素，斑马鱼MT受体MT1（或MTNR1A）和MT2(MTNR1B）主要由mtnr1aa、mtnr1a1、mtnr1ba、mtnr1bb等基因编码[22]。MT可以通过促进睡眠及减少运动来改善斑马鱼的急性焦虑状态[23]。既往研究[12,24,25]发现，咖啡因可抑制斑马鱼GABA活性并下调GABA受体。睡眠剥夺动物实验[26,27]结果中，5-HT升高或降低均有报道，其升高或降低均可影响睡眠。但短期应用咖啡因造模后，斑马鱼体内呈现5-HT及其代谢物5-HIAA水平升高趋势[12,28]。同时，咖啡因可降低斑马鱼褪黑素mtnr1的基因水平[6]。本研究结果与其他药物筛选机制一致，结果表明300μmol/L咖啡因造模后斑马鱼幼鱼体内GABA、MT含量减少，5-HT含量升高，与相关基因紊乱相关。益神宁心方可能通过上调gabra1、gabrg2、mtnr1aa和mtnr1ba的表达，下调htr1aa和htr1bd的表达水平，对失眠斑马鱼起到镇静催眠、减少焦虑进而改善睡眠质量的作用。

综上所述，咖啡因造模可引起斑马鱼运动行为的增强及焦虑行为的变化，本研究结果提示，咖啡因导致的行为学变化与GABA、5-HT和MT含量及其相关基因表达异常密切关联。益神宁心方可以显著改善咖啡因造模后斑马鱼的行为学特征并改善焦虑样行为变化，同时可使斑马鱼幼鱼体内GABA、5-HT、MT相关紊乱的基因表达水平趋于正常，体现了中药治疗的多靶点效应，可为临床治疗不寐药物的研究提供实验依据。本研究尚存在一定的不足，如失眠、焦虑是一个长期演变的过程，而本研究在观察动物实验疗效时仅进行了1 h的行为学观察。咖啡因可制造睡眠剥夺和焦虑模型，但睡眠的昼夜节律与光照更相关，课题组有关光照及昼夜节律的实验依然在探索中。

参考文献:

[1]张瑞,黄瑶,史佳宁,等.张振贤教授基于“昼精夜瞑”理论辨治不寐病[J].中医药信息,2023, 40(6):23-26.

[2]张瑞,裴燕,黄雪元.益神宁心方对慢性失眠患者睡眠质量及焦虑､抑郁情绪的影响[J].湖北中医药大学学报,2019, 21(3):89-92.

[3]史佳宁,柴瑞佳,黄瑶,等.益神宁心方对原发性失眠心脾两虚型患者唾液褪黑素､皮质醇水平的影响[J].中医杂志,2021, 62(24):2157-2163.

[5]孙毅红,刘心朗,周丽丽,等.睡眠障碍发病机制及对神经退行性病变的影响[J].中国老年学杂志,2022, 42(7):1763.

[6]何东方,张丽军,刘梅颜.药物处理对失眠症斑马鱼睡眠的影响以及相关作用机制[J].中国循证心血管医学杂志,2017, 9(3):326-330.

[7]简静,林佳,刘秀云,等.毛果芸香碱对不同光照下斑马鱼幼鱼自发运动和焦虑性行为的影响[J].复旦学报(医学版),2019, 46(5):667-675.

[9]冉思邈,谭爱华,石和元,等.咖啡因与光照诱导斑马鱼睡眠剥夺模型行为学研究[J].海南医学院学报,2021, 27(22):1687-1691.

[10]汪卿,游秋云,丁莉,等.安寐丹干预斑马鱼睡眠剥夺模型昼夜节律及能量代谢作用机制研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2022, 24(12):4873-4880.

[14]中华医学会神经病学分会,中华医学会神经病学分会睡眠障碍学组,中华医学会神经病学分会神经心理与行为神经病学学组.中国成人失眠伴抑郁焦虑诊治专家共识[J].中华神经科杂志,2020,53(8):564-574.

[15]闫德祺,张星平,么嵌巍,等.志不安于肾和魄不安于肺不寐大鼠体内γ-氨基丁酸和谷氨酸的差异研究[J].上海中医药杂志,2023,57(3):87-92.

[19]赵娜,谢晨,杨文佳,等.中枢五羟色胺与睡眠-觉醒[J].脑与神经疾病杂志,2023, 31(7):454-458.

[21]周旖妮.盐酸伪麻黄碱通过五羟色胺和多巴胺影响斑马鱼的行为[D].通辽:内蒙古民族大学,2022.

基金资助:上海市卫健委上海市中医药事业发展三年行动计划项目[ZY(2018-2020)-ZWB-1001];上海市嘉定区自然科学基金项目(JDKW20200017);

文章来源:张瑞,张振贤,史佳宁等.益神宁心方对斑马鱼睡眠剥夺模型行为学及神经递质的影响[J].上海中医药杂志,2024,58(01):89-95.