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基于免疫调节探讨葛根汤颗粒治疗小鼠病毒性肺炎的作用机制

2024-02-19 169 上传者：管理员

摘要：目的研究葛根汤颗粒对甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)致小鼠病毒性肺炎模型的药效评价及免疫调节作用。方法 ICR小鼠，13～15 g，分为正常对照组、模型对照组，磷酸奥司他韦阳性药对照组及葛根汤颗粒高、中、低剂量组(6.6、3.3、1.7 g-1·kg-1·d-1)，每组10只，采用IAV(FM1株)病毒液感染建立小鼠病毒性肺炎模型，同时给予相关药物治疗。观察各组小鼠肺指数及肺指数抑制率，RT-PCR法检测肺组织核酸，ELISA法检测小鼠肺组织因子白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子TNF-α；同时采用IAV(FM1株)病毒液滴鼻感染小鼠，造成死亡保护模型，观察小鼠感染后2周内的死亡情况，计算小鼠的死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率。结果葛根汤颗粒中剂量组肺指数及肺组织病毒载量显著降低(P<0.01)，肺指数抑制率为50.73%；葛根汤颗粒高、中剂量组肺组织炎性因子IL-10含量显著降低(P<0.01)、葛根汤颗粒中、低剂量组肺组织炎性因子TNF-α含量显著降低(P<0.01)；葛根汤颗粒3个剂量组肺组织炎性因子IL-6含量显著降低(P<0.01)；模型组小鼠死亡率90%，平均存活天数9.45 d，葛根汤颗粒3个剂量组小鼠死亡率显著降低、平均存活天数显著延长，生命延长率显著提高(P<0.01)。结论葛根汤颗粒可通过调节模型小鼠免疫炎性因子水平达到改善病毒性肺炎小鼠免疫功能的作用，同时可显著降低模型小鼠肺指数和肺组织病毒载量，从而减轻模型小鼠的肺部炎性损伤；对模型小鼠有死亡保护作用。

关键词：
免疫调节
死亡保护
炎性因子
甲型流感病毒
肺指数
葛根汤颗粒
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甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）导致的肺部感染疾病，已严重影响人类健康和威胁公共卫生安全[1,2,3]。据世界卫生组织统计，每年季节性流感导致的重症病例已达300～500万人，年死亡数上线接近65万人，尤其对孕妇、婴幼儿、老年人及有基础病人群重症率和死亡率直线上升[4,5,6]，因此，寻找耐药性强和临床疗效好的抗流感病毒药物是预防和控制流感的必要手段之一。

中医药在治疗病毒感染性疾病方面有其悠久的历史和理论基础，流感属中医疫病中的“时行感冒”范畴，《瘟疫论》[7]认为“瘟疫之为病，非风、非寒、非暑、非湿，乃天地间别有一种异气所感”，“感天地之异气……此气之来，无论老少强弱，触之者即病”。因此，流感不同于普通“感冒”，具有突然爆发，快速蔓延，起病急骤，病情较重，并发症多发的特点[8,9,10]。葛根汤颗粒由葛根、麻黄、白芍、桂枝、甘草、大枣、生姜组成，具有发汗解表，升津舒筋的功效。本研究中选择葛根汤颗粒作为治疗药物，通过对感染模型小鼠肺组织炎症损伤、肺组织核酸及肺组织免疫炎性因子等指标变化的探查，揭示其治疗流感病毒致小鼠肺炎模型的作用机制。

1、材料

1.1 动物

ICR幼龄小鼠，SPF级，体质量（14±1)g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK（京）2016-0006，合格证号：1100112111106103862、110011211106103978、110011211106140787、110011211106140838。饲养条件：ABSL-2实验室，-20 Pa，环境温度21～23℃，湿度40%～50%，实验操作严格按照生物安全实验室管理要求完成，符合北京市实验动物伦理委员会规定，由中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会给予批准，批准号：2021D056。

1.2 病毒毒株

甲型H1N1流感病毒（FM1株），购自美国标准生物品收藏中心（ATCC）。由本所ABSL-2+生物安全实验室常规传代，-80℃冰箱保存备用。

1.3 药物及试剂

葛根汤颗粒（瑞阳制药股份有限公司，批号：21032321，每袋6 g）；磷酸奥司他韦颗粒（宜昌东阳光长江药业股份有限公司，批号：0651912300，每袋15 mg）；日本葛根汤1(tsumura津村株式会社，批号：R24831，每袋2.5 g）；日本葛根汤2（井藤汉方制药株式会社，批号：AA0442-6，每袋1.5 g）；异氟烷（上海玉研科学仪器有限公司，批号：S200106）；甲型H1N1流感病毒PCR试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司，批号：P20200101);IL-6、TNF-α试剂盒（莱兹生物科技有限公司，批号：269392-001、234889-020）、IL-10试剂盒（上海酶联，批号：05/2021）。

1.4 仪器

A2型生物安全柜（美国Thermo公司，型号：MSC-Advantage 1.8）；电子天平（上海越平科学仪器有限公司，型号：YP1002）；电子分析天平（美国Ohaus公司，型号：AR1140);IVC小鼠饲养笼（苏州冯氏股份有限公司，型号：ZJ-4);Real-Time PCR仪（美国Applied biosystems公司，型号：Quant Studio 5）；八连排管迷你离心机（Kylin-Bell Lab公司，型号：LX-300）；迷你涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器公司，型号：OL-901）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：Eppendorf-5810R）；多功能酶标仪（德国Perkin Elmer公司，型号：Enspire）；组织匀浆仪（美国MP公司，型号：Fast Pre-24TM）。

2、方法

2.1剂量设计

葛根汤颗粒，人临床用量为18 g·60 kg-1·d-1，即0.3 g·kg-1体重，实验时小鼠用量分别设6.6、3.3、1.7 g·kg-1·d-1 3个剂量，分别相当于临床2倍、等倍及1/2倍剂量。

日本葛根汤1：人临床用量为5 g·60 kg-1·d-1，即0.083 g·kg-1体重，实验时小鼠用量为0.9 g·kg-1·d-1；日本葛根汤2：人临床用量为4.5 g·60 kg-1·d-1，即0.075 g·kg-1体重，实验时小鼠用量为0.8 g·kg-1·d-1；磷酸奥司他韦颗粒：人临床用量为150 mg·60 kg-1·d-1，即2.5 mg·kg-1体重，实验时小鼠用量为27.5 mg·kg-1·d-1；均相当于人临床等倍剂量。

给药时：按0.2 g·10 m L-1·d-1给予灌胃给药，每日1次，连续4 d。

2.2 实验造模

小鼠病毒性肺炎模型：取ICR小鼠80只，体重（14±1)g，雌雄各半，按体重等级随机分为8组，分别为正常对照组、模型对照组、磷酸奥司他韦对照组、日本葛根汤1对照组、日本葛根汤2对照组、葛根汤颗粒高、中、低3个剂量组，每组10只。除正常对照组外，将小鼠用异氟烷轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液（H1N1/FM1株）滴鼻感染，每只35μL。感染当天开始给药，每次按0.2 m L·10 g-1灌胃，每日1次，连续4 d，正常对照组和模型对照组在同等条件下以蒸馏水灌胃。第5天各组小鼠称体重；解剖称肺重，取肺组织一部分进行核酸检测，另一部分进行肺组织炎性因子检测。

小鼠死亡保护模型：取ICR小鼠140只，体重（14±1)g，雌雄各半，按体重等级随机分为7组，分别为模型对照组、磷酸奥司他韦对照组、日本葛根汤1对照组、日本葛根汤2对照组、葛根汤颗粒高、中、低3个剂量组，每组20只。各组小鼠用异氟烷轻度麻醉，以2个LD50流感病毒液（FM1株）滴鼻感染，每只35μL。感染当天开始给药，各组小鼠每次按0.2 m L·10 g-1灌胃，每日1次，连续4 d，模型对照组在同等条件下以蒸馏水灌胃。观察感染后2周内动物的死亡情况。肺指数及肺指数抑制率计算方法，计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率详见公式。

2.5 RT-PCR法检测肺组织核酸含量

核酸提取：将小鼠肺组织从-80℃低温冰箱中取出，每个肺组织加入1 m L TRIzol Reagent，进行组织匀浆；提取肺组织中RNA；核酸检测：DEPC-H2O作为阴性对照，阳性对照品进行10、100、1 000倍梯度稀释；取n×18µL甲型流感病毒核酸荧光PCR检测混合液，n×1µL内部对照品，与n×1µL RT-PCR酶（n为反应管数），3 000 rpm离心数秒；取上述混合液20µL置于PCR管中，然后将样品核酸提取液、DEPC-H2O、阳性对照品各5µL分别加入PCR管中，进行PCR扩增反应；上机检测：循环参数设置为：45℃×10 min;95℃×15 min，再按95℃×15sec→60℃×60 sec，循环40次，单点荧光检测在60℃，反应体系为25µL；选用FAM和HEX/VIC/JOE通道，上机检测。

2.6 Elisa法检测小鼠肺组织I L-6、I L-10、T N F-α含量

将肺组织从-80℃低温冰箱中取出，用高效蛋白裂解液（已加入PMSF及蛋白酶抑制剂）处理肺组织后离心，取蛋白上清用于检测。检测时按照试剂盒说明书检测，用酶标仪检测450 nm的吸光度。

2.7 统计分析

采用SPSS19.0软件进行数据分析，以表示，采用t检验进行组间比较，P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺指数及肺指数抑制率的影响

采用甲型H1N1流感病毒（FM1株）感染小鼠后，模型对照组小鼠肺指数明显增高，与正常对照组比较有显著差异（P<0.01）；感染当天开始给予葛根汤颗粒治疗4 d，葛根汤颗粒中剂量组肺指数明显降低，与模型对照组比较有显著差异（P<0.01），葛根汤颗粒中剂量组肺指数抑制率为50.73%（图1）。

图1 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺指数的影响

3.2 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺组织中病毒载量的影响

采用甲型H1N1流感病毒（FM1株）病毒感染小鼠后，模型对照组小鼠肺组织病毒载量明显增高，与正常对照组比较有显著差异（P<0.01）；感染当天开始给予葛根汤颗粒治疗4 d，葛根汤颗粒中剂量组肺组织病毒载量明显降低，与模型对照组比较有显著差异（P<0.01）（图2）。

3.3 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺组织细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10含量的影响

采用甲型H1N1流感病毒（FM1株）感染小鼠后，模型对照组小鼠肺组织细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10含量明显增高，与正常对照组比较有显著差异（P<0.01）；感染当天开始给予葛根汤颗粒治疗4 d，葛根汤高、中剂量组IL-10含量显著降低；葛根汤中、低剂量组TNF-α含量显著降低；葛根汤3个剂量组的IL-6含量显著降低，与模型对照组比较有显著差异（P<0.01）（图3～5）。

图2 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺组织病毒载量的影响

图3 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺组织细胞因子TNF-α含量的影响

3.4 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠死亡保护模型的影响

采用甲型H1N1流感病毒FM1株病毒感染小鼠2周内，模型对照组动物死亡率为90%，平均存活天数为9.45 d；感染当天开始给予葛根汤颗粒，连续4 d，葛根汤颗粒3个剂量组小鼠死亡率明显降低，并显著延长小鼠存活天数，与模型对照组比较均有显著差异（P<0.01）（图6，表1）。

图4 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺组织细胞因子IL-6含量的影响

图5 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠模型肺组织细胞因子IL-10含量的影响

4、讨论

IAV是一种具有包膜的单股负链核糖核酸（RNA）病毒，具有广泛的宿主适应性，属正黏病毒科，包含8个基因组片段，主要的表面蛋白为血凝素（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶（neuraminidase,NA），能够感染包括野禽、猪、蝙蝠和人类等多种宿主[11,12,13]。随着病毒变异和耐药性的出现，由IAV感染引起的肺部感染性疾病呈现不同区域集中爆发的流行特点[14]。

图6 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠死亡保护模型生存曲线图

本实验采用IAV感染建立小鼠病毒性肺炎模型和死亡保护模型，模型小鼠肺指数及肺指数抑制率显著升高、肺组织核酸表达为阳性，同时死亡保护模型中，模型小鼠死亡率达90%，以上指标的变化表明流感病毒感染致小鼠病毒性肺炎模型造模成功。同时，给予中药葛根汤颗粒进行治疗，结果提示葛根汤可通过降低模型小鼠的肺指数、肺组织病毒载量的表达及死亡保护率，提高模型小鼠的平均存活天数及生命延长率发挥抗病毒性肺炎的治疗作用。实验时采用日本葛根汤和磷酸奥司他韦作为阳性对照药，结果显示葛根汤颗粒与西药对照药疗效相当，且优于日本葛根汤方组。同时，实验室前期研究发现葛根汤颗粒对人冠状病毒、流感病毒PR8株所致的肺炎均有一定的治疗作用[15,16]，研究表明葛根汤颗粒对不同呼吸道病毒引起的肺炎均具有治疗作用。

IAV感染可诱导TNF-α、IL-6、IL-10等免疫炎性细胞因子大量产生，激活宿主抗病毒先天免疫应答及适应性免疫，引发炎症级联效应，导致“炎性细胞因子风暴”的产生，推测这也是导致流感后期出现重症的原因之一[17,18]。IL-6主要由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等多种细胞产生，主要通过JAK/STAT3、PI3K/AKT和NF-κB信号通路发挥免疫调节和促炎作用[19,20]。IL-10是Th2细胞分泌的标志性细胞因子，主要由活化的T细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和B细胞产生，主要通过JAK/STAT3、PI3K/AKT等途径发挥调控炎症和免疫的作用[21,22]。TNF-α主要由巨噬细胞、淋巴细胞和嗜中性粒细胞等细胞分泌的炎性因子，具有通过免疫细胞发育、稳态、激活及免疫耐受等调控炎症反应的作用，主要通过PI3K/AKT和NF-κB信号通路实现免疫调节功能[23]。本实验研究发现，采用IAV感染建立小鼠病毒性肺炎模型，模型小鼠肺组织炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10显著升高，提示病毒在感染过程中，过度激活宿主导致出现了较强的应激反应，从而引起了病毒性肺炎的发生。而通过给予中药葛根汤颗粒进行治疗，发现其可显著下调肺组织中TNF-α、IL-6、IL-10因子的表达，提示葛根汤颗粒可能是通过抑制促炎因子的表达发挥免疫调节和抑制病毒复制的作用。

综上所述，本实验从小鼠肺部炎症表现、肺组织核酸、肺组织炎性因子含量、死亡保护率、平均存活天数及生命延长率等方面对IAV感染诱导的小鼠病毒性肺炎模型和死亡保护模型进行评价，给予葛根汤颗粒干预后，发现其通过调节宿主免疫应答环节发挥抑制病毒复制的作用，对于炎性因子涉及的相关通路的表达机制还有待进一步研究。

表1 葛根汤颗粒对病毒性肺炎小鼠死亡保护模型的影响

基金资助:中国中医科学院创新工程重点项目(CI2021A04606);国家重点研发计划(2020YFE0205100);

文章来源:赵荣华,孙静,包蕾等.基于免疫调节探讨葛根汤颗粒治疗小鼠病毒性肺炎的作用机制[J].中国药物警戒,2024,21(02):132-136+151.