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黄芪多糖对H22荷瘤小鼠PD-1抑制剂抗癌能力的影响

2024-03-19 120 上传者：管理员

摘要：目的:以H22荷瘤小鼠为模型，观察黄芪多糖(APS)对PD-1抑制剂抗癌能力的增强效果并探讨其机制。方法:建立H22荷瘤小鼠模型，分别给予PD-1抑制剂和/或不同浓度APS处理，记录肿瘤生长情况，ELISA法检测肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、转化生长因子(TGF-β)等血浆细胞因子浓度，Western Blot法检测肿瘤及脾脏组织PD-1表达，流式细胞术检测肿瘤浸润细胞类型。结果:(1)APS及PD-1抑制剂均能抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤生长，联合用药效果更为显著，且抑制强度随APS浓度上升而增加。(2)APS联合PD-1抑制剂作用后，血浆TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10、TGF-β浓度上升，IL-2、IL-4血浆浓度下降，肿瘤及脾脏组织PD-1蛋白表达下降，肿瘤组织CD+4CD-8细胞和CD+4CD+8细胞浸润比例增加。结论:APS能增强PD-1抑制剂抗H22肝癌能力，可能与调节细胞因子分泌、抑制PD-1表达、增加肿瘤组织淋巴细胞浸润相关。

关键词：
PD-1蛋白
免疫检查点
细胞因子
肝细胞癌
肿瘤生长
黄芪多糖
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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌最常见的组织学类型，免疫检测功能缺陷是HCC发生进展的主要机制之一，常表现为免疫检查点导致的效应T细胞功能抑制[1]。程序性细胞死亡分子 1(programmed cell death 1,PD-1)是目前主要研究的免疫检查点，已有多款PD-1抑制剂用于临床，但与化疗和分子靶向治疗相比响应率偏低，多数患者对治疗无应答或治疗后复发。传统中药材黄芪自古被视为“补药之长”,性味甘微温，主要功效为益卫固表、升阳举陷、健脾补中，具有免疫调节功能及抗癌活性[2,3]。黄芪主要活性成分黄芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)具有介导免疫防御，对抗免疫抑制，提高机体免疫力等作用[4]。本研究以H22荷瘤小鼠为模型，旨在验证APS对PD-1抑制剂抗癌能力的增强效果并探讨其可能的作用机制。

1、实验材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性BALB/c小鼠60 只，6～8 周龄，体质量(20±2) g, 购自上海斯莱克实验动物有限公司，货号：20170005040562。于浙江中医药大学动物实验中心小鼠实验室饲养，饲养环境：温度为 18～29 ℃,日温差≤3 ℃,相对湿度达40%～70%,昼夜明暗交替，自由进食、饮水。适应性饲养1 周。实验动物饲养设施合格证号：SYXK(浙)2018-0012。实验研究符合中国伦理委员会实验动物研究指导原则。

1.2 细胞与药物

H22肝癌细胞：武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：CL-0341。PD-1抑制剂：MedChemExpress, 货号：HY-19991;黄芪多糖(APS):Santa cruz, 货号：7727-54-0。

1.3 试剂与仪器

TNF-α,IL-1β,IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10,TGF-β ELISA试剂盒：南京建成生物工程公司，货号：H052-1、H002、H003、H025、H005、H009-1、H034-1;PBS溶液：Solarbio; RPMI1640培养基：Thermo fisher; PD-1抗体：Abcam, 货号：Ab214421;GAPDH抗体：Proteintech; 羊抗鼠HRP标记二抗：碧云天；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒：Beyotime; CD8 a Monoclonal Antibody, PE、CD4 Monoclonal Antibody, FITC:eBioscience; 胶原酶Ⅳ:Sigma。电泳仪：BIO-RAD 公司；PS-9电转仪：大连竞迈科技有限公司；MK3酶标仪：芬兰雷勃酶标仪；Tanon-5200成像系统：Tanon; TDZ4-WS离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；CytoFLEX流式细胞仪：Beckman; CO2恒温培养箱：Thermo。

2、方法

2.1 H22荷瘤小鼠造模

随机数表法随机选择小鼠10 只，选用正常传代的H22肝癌细胞，接种于小鼠腹腔，6 d后处死，无菌取腹水，用PBS稀释成肿瘤细胞悬液，离心收集细胞，无血清培养基重悬处理后调整细胞浓度为1.5×107个/mL并保存。随机选择小鼠40 只，将H22细胞200 μL(3×106个)接种于小鼠前肢腋下，所有小鼠接种后每天进行测量并记录，肿瘤体积(V)=a×b2/2(a为长径，b为短径),肿瘤体积达50～100 mm3时即为造模成功。另随机选择6 只小鼠同时间于前肢腋下接种200 μL无血清培养基作为正常对照组。

2.2 动物分组及给药

以荷瘤小鼠肿瘤体积达50～100 mm3时为d0,正常小鼠同时期设定为d0。造模成功荷瘤小鼠按照随机数表法随机选择36 只并随机分为6 组，每组6 只。分别为：荷瘤对照(Model)组、APS组、PD-1组、PD-1+低剂量APS(P+APS L)组、PD-1+中剂量APS(P+APS M)组、PD-1+高剂量APS(P+APS H)。各组小鼠给药量依照临床PD-1抑制剂及黄芪常用剂量根据《人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表》及参考同类研究[5,6]代换为小鼠剂量，具体见表1。

表1 各组小鼠给药方案导

2.3 观察指标

2.3.1 肿瘤生长情况

各组小鼠分别于d1、d3、d5、d7、d9、d11、d13用游标卡尺测量肿瘤大小并记录，d14处死小鼠后切除肿瘤组织拍照并称重记录。

2.3.2 血浆细胞因子测定

各组小鼠处死前摘取眼球取血约2 mL,离心后，取上清(血浆),-80 ℃保存。以ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β等免疫相关细胞因子浓度。

2.3.3 Western Blot法检测肿瘤和脾组织PD-1蛋白表达

颈椎脱臼法处死各组小鼠，正常对照组取接种部位组织及脾脏，其余各组暴露肿瘤及脾脏，取出标本于-80 ℃保存。取肿瘤及脾脏组织各20 mg, 液氮研磨组织直至成粉末状，将粉末倒入无菌EP管中；200μL RIPA裂解液冰上裂解，抽提细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，-20 ℃下保存样品备用。等量蛋白浓度样本SDS-PAGE后电转移至PVDF膜，以鼠抗人PD-1为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，采用Western blot法检测目的杂交条带，凝胶图象分析系统测定杂交条带灰度值进行半定量。以GAPDH为内参。

2.3.4 流式细胞术检测肿瘤组织CD4/CD8表型

取适量肿瘤组织转移至无菌EP管中，剪碎组织成泥状，加0.1μg/L IV型胶原酶在37 ℃摇床下孵育40 min, 加入含体积分数1%FBS的PBS终止反应，离心，去上清，每管加入2 mL红细胞裂解液混匀，冰上裂解，离心，去上清，PBS清洗2 次后，去上清，加入 200μL PBS 重悬细胞，将其分装至EP管中，加入FITC偶联的抗小鼠CD4及PE偶联的抗小鼠CD8流式抗体，冰上避光染色30 min。加入1 mL PBS终止染色，离心，去上清，300μL PBS重悬，上机检测。

2.4 统计学方法

实验数据用表示，多组均数间比较采用one-way ANOVA检验。通过IBM SPSS Statistics 19软件实施，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1 黄芪多糖对PD-1抑制剂肿瘤抑制作用的协同增强效果

与模型组比较，各药物干预组肿瘤体积缩小，肿瘤生长曲线降低，肿瘤重量下降，见表2,图1;统计分析提示各组平均瘤重存在差异(F=321.580,P<0.01),进一步两两比较各组组间差异均存在统计学意义(P<0.05)。

表2 各组荷瘤小鼠肿瘤重量及体积比较

图1 各组小鼠肿瘤生长曲线

3.2 黄芪多糖对细胞因子分泌的影响

各组小鼠血浆中TNF-α(F=15.51,P<0.01)、IL-1β(F=32.43,P<0.01)、 IFN-γ(F=25.96, P<0.01)、IL-10(F=21.38,P<0.01)、TGF-β(F=31.13,P<0.01)、IL-2(F=20.71,P<0.01)、IL-4(F=9.22,P<0.01)等细胞因子浓度均存在差异，进一步两两比较各组间差异见表3。

3.3 黄芪多糖对肿瘤及脾脏组织PD-1表达的影响

PD-1表达在各组小鼠肿瘤组织(F=14.55,P<0.01)及脾脏组织(F=8.986,P<0.01)存在差异，进一步两两比较各组间差异见图2。

3.4 黄芪多糖对肿瘤组织浸润细胞CD4/CD8表型占比的影响

各组小鼠肿瘤组织内浸润CD-4CD-8细胞(F=241.99,P<0.01)、CD+4CD-8细胞(F=274.78,P<0.01)、CD+4CD+8细胞(F=62.46,P<0.01)平均百分占比存在差异，基本未发现CD-4CD+8细胞存在；进一步两两比较结果见表4。

表3 各组小鼠血浆TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、TGF-β水平比较

4、讨论

原发性肝癌是我国第4 位常见恶性肿瘤，及第2 位肿瘤致死病因，严重威胁国民的生命健康[7],以PD-1抑制剂为代表的免疫治疗是主要疗法之一，其中纳武利尤单抗联合伊匹木单抗获得美国FDA批准用于HCC二线治疗[8]。抑制免疫检查点能够逆转肿瘤微环境的免疫抑制状态，增强机体对肿瘤细胞的清除能力[9];但PD-1抑制剂与化疗和分子靶向治疗相比响应率偏低，多数患者对治疗无应答或治疗后复发。一项包含了多种类肿瘤的回顾性研究显示其响应率为27%[10],更广泛的报道称在实体瘤中该数值为10%～30%[11]。响应率偏低的原因可能与效应T细胞PD-1高表达[12]、肿瘤微环境中缺乏效应T细胞浸润[13]及效应T细胞活性低下[14]相关。中医药是肿瘤综合治疗的重要组成部分，与放疗、化疗、靶向药物等联合应用具有“增效减毒”的协同作用。本研究以H22荷瘤小鼠为模型，旨在验证APS增强PD-1抑制剂抗癌能力并探讨其可能的机制。研究结果表明，APS及PD-1抑制剂均能抑制H22荷瘤小鼠模型肿瘤的生长，联合用药组则效果更为显著，且抑制强度随APS浓度上升而增加。

肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)由肿瘤细胞、免疫细胞、血管内皮细胞和细胞外基质等组成[15],不同个体间TME由于异质性存在较大区别[16]。TME中效应T细胞的浸润程度及活性与免疫治疗疗效密切相关，研究表明在免疫豁免型TME中仅存在少量抑制性免疫细胞，效应性免疫细胞无法有效浸润至TME,难以发挥抗癌活性[17]。CD4及CD8是T细胞表面标志性的分化抗原：CD+4T细胞属于辅助T细胞，具有调节免疫效应的功能；CD+4CD+8T淋巴细胞主要存在于肿瘤组织与非肿瘤组织交界处，由CD+8T细胞发育而来，表面同时表达免疫耗竭和激活标志物，体外研究表明具有免疫活性，其数量与HCC患者预后呈正相关[18]。本研究结果显示APS联合PD-1抑制剂作用后，肿瘤组织CD+4CD-8细胞和CD+4CD+8细胞浸润比例增加。

图2 各组小鼠肿瘤组织、脾脏组织PD-1蛋白表达量比较

表4 各组荷瘤小鼠肿瘤组织浸润细胞CD4/CD8表型占比比较

PD-1可表达于活化的CD+4和CD+8T细胞表面[19]。研究表明肿瘤细胞表面高表达PD-1配体(programmed cell death ligand 1,PD-L1),与PD-1结合后抑制T细胞TCR信号传导，诱导T细胞凋亡，抑制T细胞增殖及活性，降低免疫系统对肿瘤杀伤能力[14]。PD-1抑制剂作为抗PD-1抗体竞争性结合PD-1,阻断前述效应发生，但若T淋巴细胞表面高表达PD-1则不能从中获益甚至降低疗效[12],提示在PD-1高表达下，PD-1抑制剂不足以完全阻断PD-L1与PD-1结合；APS可能通过抑制T淋巴细胞表面PD-1表达以协同PD-1抑制剂发挥疗效。本文研究结果可见，APS联合PD-1抑制剂作用后肿瘤及脾脏组织PD-1蛋白表达下降。

传统认为促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2促进效应T细胞活化，而抑炎细胞因子IL-4、IL-10、TGF-β作用相反。有研究表明APS能增强T细胞分泌IL-2、TNF-α的能力[20,21],减少TME中TGF-β、IL-10的产生[20]。但本研究中观察到TNF-α、IL-1β、IFNγ血清浓度上升，IL-2却下降；IL-4血清浓度下降，TGF-β、IL-10却上升；提示APS在PD-1抑制剂协同下，可能存在对细胞因子分泌的双向调节作用。笔者认为，可能是由于在APS与PD-1抑制剂协同作用下，机体表现为免疫激活的炎症状态，TNF-α、IL-1β、IFNγ分泌增加；但同时由于免疫自平衡调节，为抑制过度激活的炎症反应，IL-2分泌减少，TGF-β、IL-10分泌增加。APS是否在这一过程中起到调节作用，仍需要进一步的研究。

综上所述，本研究确定APS能增强PD-1抑制剂抗癌能力，这可能与调节细胞因子分泌、抑制PD-1表达、增加肿瘤组织淋巴细胞浸润等相关。

参考文献:

[2]秦书敏,林静瑜,黄可儿.黄芪的免疫调节作用研究概述[J].中华中医药学刊,2017,35(3):699-702.

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[5]王洁茹,王金英,张婷婷,等.黄芪多糖调节黑色素瘤小鼠PD-1/PD-Ls分子表达的研究[J].上海中医药大学学报,2014,28(5):74-79.

[6]祝保艳,李婧婧,李丹丹,等.卡博替尼联合 PD-L1 单抗对黑色素瘤小鼠移植瘤的抑制作用机制[J].中山大学学报(医学科学版),2019,40(2):172-178.

[7]中华人民共和国国家卫生健康委员会医政医管局.原发性肝癌诊疗规范(2019年版)[J].中华消化病与影像杂志(电子版),2020,10(1):22-48.

基金资助:浙江省中医药科技计划青年人才基金项目(2020ZQ041);

文章来源:林泽晨,周河燃,钟亚珍等.黄芪多糖对H22荷瘤小鼠PD-1抑制剂抗癌能力的影响[J].中国中医药科技,2024,31(02):217-222.