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藁本内酯对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织损伤的影响

2024-06-06 152 上传者：管理员

摘要：目的研究藁本内酯调控干扰素基因刺激蛋白(STING)/TANK结合激酶1(TBK1)/核因子-κB(NF-κB)信号对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织损伤的影响。方法将小鼠分成对照组、模型组(LPS肺损伤小鼠模型)、实验低剂量组(LPS肺损伤小鼠模型，20 mg·kg-1藁本内酯)、实验中剂量组(LPS肺损伤小鼠模型，60 mg·kg-1藁本内酯)、实验高剂量组(LPS肺损伤小鼠模型，100 mg·kg-1的藁本内酯)、DMXAA组(LPS肺损伤小鼠模型，100 mg·kg-1的藁本内酯、STING信号激动药DMXAA)。用蛋白质印迹法检测STING、p-TBK1、TBK1、p-p65、p65蛋白的表达水平，用二喹啉甲酸(BCA)法检测肺泡灌洗液总蛋白，用瑞士吉姆萨染色计数肺泡灌洗液中炎性细胞数目，用酶联免疫吸附测定法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，用硫代巴比妥酸法检测肺组织中丙二醛(MDA)含量。结果对照组、模型组和实验低、中、高剂量组及DMXAA组的STING蛋白相对表达水平分别为0.13±0.03、0.46±0.02、0.36±0.04、0.27±0.02、0.20±0.03和0.38±0.04,p-TBK1/TBK1蛋白比值分别为0.15±0.02、0.56±0.02、0.43±0.01、0.31±0.01、0.20±0.02和0.30±0.02,p-p65/p65蛋白比值分别为0.24±0.01、0.66±0.03、0.41±0.02、0.32±0.04、0.22±0.02和0.42±0.03,肺泡灌洗液中总蛋白含量分别为(173.79±15.44)、(304.21±19.29)、(243.59±17.60)、(212.51±18.24)、(187.11±11.59)和(241.69±30.12)μg·mL-1,巨噬细胞数目分别为(0.11±0.02)×108、(0.94±0.09)×108、(0.72±0.08)×108、(0.57±0.04)×108、(0.41±0.04)×108和(0.71±0.08)×108cell·mL-1,模型组的上述指标与对照组相比，实验低、中、高剂量组的上述指标与模型组相比，DMXAA组的上述指标与实验高剂量组相比，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论藁本内酯抑制STING/TBK1/NF-κB信号减轻LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织损伤。

关键词：
干扰素基因刺激蛋白/TANK结合激酶1/核因子-κB信号
急性肺损伤
氧化损伤
炎症
藁本内酯
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急性肺损伤可发展为急性呼吸窘迫综合征。肺组织感染、有毒气体吸入、肺挫伤、脓毒血症等是诱导急性肺损伤的重要原因，氧化损伤、炎症等是急性肺损伤的常见病理变化[1]。藁本内酯存在于川芎、当归等中药中，其是苯酞类物质，有神经保护、消炎、抗氧化等功效[2]。藁本内酯能够抑制肺炎链球菌、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等诱导的肺上皮细胞损伤，这提示藁本内酯可能具有肺损伤保护作用[3,4]。本实验旨在研究藁本内酯对LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织损伤的作用和机制。

一、材料与方法

1、材料

动物SPF级C57BL/6小鼠，雌性，鼠龄6～8周，体质量20～25 g, 购自福州海王福药制药有限公司。动物生产许可证号：SCXK(闽)2020-0001。本实验经福州市第二医院临床研究与应用管理委员会批准(伦理批号：20230228)。

药品与试剂藁本内酯，规格：每瓶20 mg, 纯度：98%,批号：20210215,成都瑞芬思德丹生物科技有限公司生产；干扰素基因刺激蛋白(stimulator of inter-feron genes, STING)信号激动药DMXAA,规格：每瓶5 mg, 纯度：98%,批号：20220512,美国Sigma公司生产。兔抗磷酸化TANK结合激酶1(phosphorylation TANK binding kinase 1, p-TBK1)抗体、兔抗STING抗体，兔抗磷酸化核因子-κB p65(phosphorylation nuclear factor-κB p65,p-p65)抗体、兔抗p65抗体，均购自英国Abcam公司；白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)试剂盒，上海白益生物科技公司生产；兔抗TBK1抗体、丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测试剂盒，均为上海碧云天生物技术有限公司生产；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)检测试剂盒，上海优宁维生物科技公司生产；IL-1β检测试剂盒，上海烜雅生物科技公司生产；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)检测试剂盒，北京盒子生工科技公司生产；谷胱甘肽(glutathione, GSH)检测试剂盒，北京索莱宝公司生产；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白法检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司生产。

仪器YKDZ-55显微镜，上海永科光学仪器有限公司产品；DYCZ-24F电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品。

2、实验方法

2.1 模型构建[5]5]

小鼠饲养于23～25 ℃环境中，湿度为50%左右，12 h光照，不限制饮水和采食。小鼠用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，把小鼠仰卧固定在操作板，用静脉留置针气管插管，在气管内滴注1.5 mg·mL-1的LPS溶液(2 mL·kg-1),滴注后立即左右旋转直立操作板，促进LPS进入左右两侧肺组织。

2.2 动物分组与处置方法

小鼠分成对照组、模型组、DMXAA组和实验低、中、高剂量组，每组20只小鼠。对照组滴注磷酸盐缓冲液。实验低、中、高剂量组在滴注LPS前7 d, 分别连续灌胃20、60、100 mg·kg-1的藁本内酯，每天给药1次。实验高剂量+DMXAA组在滴注LPS前7 d, 连续灌胃100 mg·kg-1的藁本内酯并腹腔注射10 mg·kg-1的DMXAA,每天给药1次。模型组和对照组用0.9%NaCl代替药物治疗。小鼠在滴注LPS后24 h, 随机将每组小鼠分成两个部分，每部分10只，一部分用于获得肺泡灌洗液，一部分分离左侧和右侧肺组织。

2.3 蛋白质印迹法检测STING、p-TBK1、TBK1、p-p65、p65蛋白的表达水平

取肺组织，提取组织蛋白后用BCA法定量。按文献[6]方法操作，Image J分析条带的灰度值。内参为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)。

2.4 瑞士吉姆萨染色分类计数炎性细胞数目[7]7]

收集肺泡灌洗液中总细胞残渣(肺泡灌洗液以3 000 ×g离心15 min, 收集沉淀),经磷酸盐缓冲液洗涤2次后，用磷酸盐缓冲溶液300 μL悬浮细胞，在显微镜下计数细胞总数，然后将细胞浓度调整到1×106 cell·mL-1,吸取悬浮液200 μL甩片，以瑞士吉姆萨染色，在油镜下分类计数炎性细胞数目。

2.5 BCA法检测肺泡灌洗液总蛋白[6]6]

取肺泡灌洗液，用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度，步骤按试剂盒说明书操作。

2.6 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平[6]6]

收集肺泡灌洗液，用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6含量，步骤按试剂盒说明书操作。

2.7 SOD、MDA、GSH水平检测[8]8]

取肺组织，用硫代巴比妥酸法检测MDA水平，用微板法检测SOD水平，用微量法检测GSH水平。

3、统计学处理

用SPSS 25.0软件进行统计分析。数据用

表示，组间比较用独立样本t检验，组内比较用配对样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1.藁本内酯对LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中STING/TBK1/NF-κB信号影响

对照组滴注磷酸盐缓冲液；模型组用LPS诱导肺损伤小鼠模型；实验低、中、高剂量组建立肺损伤小鼠模型后，分别给予20、60、100 mg·kg-1藁本内酯治疗，DMXAA组建立肺损伤小鼠模型，给予100 mg·kg-1的藁本内酯、10 mg·kg-1 DMXAA治疗。

模型组小鼠肺组织中STING、p-TBK1、p-p65蛋白相对表达水平均显著高于对照组(均P<0.05);实验低、中、高剂量组小鼠肺组织中STING、p-TBK1、p-p65蛋白相对表达水平均显著低于模型组(均P<0.05);DMXAA组小鼠肺组织中STING、p-TBK1、p-p65蛋白相对表达水平均显著高于实验高剂量组(均P<0.05)。结果见图1及表1。

图1 以蛋白质印迹法检测干扰素基因刺激蛋白(STING)/TANK结合激酶1(TBK1)/核因子-κB(NF-κB)信号相关蛋白的表达情况

2.藁本内酯对小鼠肺泡灌洗液中总蛋白、炎性细胞数目的影响

模型组小鼠肺泡灌洗液中总蛋白及炎性细胞总数均显著高于对照组(均P<0.05);实验低、中、高剂量组总蛋白及炎性细胞总数均显著低于模型组(均P<0.05);DMXAA组小鼠肺泡灌洗液中总蛋白及炎性细胞总数均显著高于实验高剂量组(均P<0.05),见表2。

3.藁本内酯对小鼠肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影响

模型组小鼠肺泡灌洗液中促炎因子含量均高于对照组(均P<0.05);与模型组比较，实验低、中、高剂量实验组的促炎因子含量均显著降低(均P<0.05);与实验高剂量组比较，DMXAA组的促炎因子含量均显著升高(均P<0.05)。结果见表3。

表1 各组急性肺损伤小鼠模型肺组织中STING、磷酸化TBK1(p-TBK1)/TBK1、磷酸化

表3 各组急性肺损伤小鼠模型肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6含量的比较

表4 各组急性肺损伤小鼠模型肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量的比较

4、藁本内酯对小鼠氧化损伤的影响

模型组小鼠肺组织中SOD、GSH含量均显著低于对照组，MDA含量显著高于对照组(均P<0.05);实验低、中、高剂量组小鼠肺组织中SOD、GSH含量均显著高于模型组，MDA含量均显著低于模型组(均P<0.05);DMXAA组小鼠肺组织中SOD、GSH含量均显著低于实验高剂量组，MDA含量显著高于实验高剂量组(均P<0.05)。结果见表4。

三、讨论

急性肺损伤可由脓毒症、创伤、肺部感染等引发，炎症、氧化损伤、肺泡毛细血液屏障损伤等均参与其中[9]。本实验结果发现，藁本内酯作用后的急性肺损伤小鼠肺组织病理损伤评分明显改善，并且肺泡灌洗液中总蛋白及炎性细胞数均降低，TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著下降，且肺组织中MDA含量显著降低，SOD、GSH水平均显著升高，这说明藁本内酯改善急性肺损伤小鼠肺组织炎症、氧化损伤和肺泡毛细血液屏障，与之前的相关研究一致，均提示藁本内酯可能是急性肺损伤的潜在治疗药物之一。

STING在人体内的多种组织中表达，是TBK1、NF-κB的激活药，参与宿主免疫反应、肿瘤发生等过程[10]。p-TBK1是TBK1的磷酸化形式。p-p65是p65的磷酸化形式，且p65是NF-κB发挥作用的关键核心因子[11]。本研究结果显示，藁本内酯降低LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织中STING、p-TBK1/TBK1、p-p65/p65蛋白表达水平，并且STING激活药可诱导STING/TBK1/NF-κB信号活化，逆转藁本内酯对急性肺损伤小鼠模型炎症、氧化损伤等的作用，这说明藁本内酯通过抑制STING/TBK1/NF-κB信号改善急性肺损伤小鼠肺组织炎症、氧化损伤、肺泡毛细血液屏障损伤。

参考文献:

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