帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是目前老年人中患中枢神经系统退行性疾病的除阿尔茨海默病以外另一类常见病症，其主要以静止性震颤及大部分伴有运动迟缓、僵硬步伐姿态改变为主要临床表现。随着人口老龄化程度的不断加剧，PD已成为全球增长最快的中枢神经系统退行性疾病。专家预测，到2040年，PD的患者将超过1 200万[1]。目前研究发现， PD的主要发病机制是脑部组织中纹状体的多巴胺递质的丢失[2]。虽然临床上已研发出抗胆碱能药、多巴胺类药等来治疗PD,但其副作用以及相关疗效却不尽如人意。所以，治疗PD药物的研发及相关靶点研究仍然迫在眉睫。

人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1, GsRb1)主要存在于人参、三七、西洋参等植物中，是人参皂苷中主要的活性成分之一[3]。研究发现GsRb1有抗肿瘤、抗炎、调节肠道菌群、抗氧化等药理作用，而且毒副作用较小[4]。有实验表明，GsRb1对于PD具有一定的治疗作用[5],但具体的作用机制尚不明确。网络药理学技术通过利用节点与对应的目标来连接从而建立网络模型，用网络的形式将抽象、单一的事物变成丰富的，然后通过进一步的具体分析，完成复杂网络的组成关系以及特征，把握药物的关键靶点，预测中药的潜在价值，最后以此来实现对生物的系统识别[6,7]。本研究拟应用网络药理学预测GsRb1治疗PD的相关作用机制，并通过分子对接进行验证，以期对其临床应用提供科学依据。

1、材料与方法

1.1 数据来源

1.1.1 GsRb1的靶点预测

本研究通过PubChem数据库查询GsRb1的结构及Canonical SMILES,将Canonical SMILES分别导入SwissTargetPrediction、SEA预测靶点[8]。

1.1.2 PD相关靶点的获取

通过在GeneCards[9]和OMIM[10]数据库中分别输入关键词“Parkinson Disease”进行检索，双库联动检索相关疾病靶点，最后将两个数据库中的靶点进行筛选，去除重复值，从而得到疾病靶点。

1.2 分析方法

1.2.1 药物-疾病靶点预测结果

将获得的药物靶点与疾病靶点相互映射，然后作Veen图，从而获得交集基因；然后使用Cytoscape 3.8.2软件构建“药物-作用靶点”网络。

1.2.2 靶蛋白相互作用网络构建

为了进一步研究GsRb1治疗PD的蛋白之间的相互作用，将上述GsRb1与帕金森疾病的基因传输至专属的相互作用的功能数据库String数据库中[11],进行蛋白相互作用网络构建(PPI);物种选择使用“Homo sapiens”,该数据库中的其余参数不做调整，保持默认设置，最后生成的GsRb1与PD的结果储存为TSV格式，导入到专用的操作软件中Cytoscap 3.8.2中，并进行分析(Cytoscape→Tools→Network analyzer→Networkanalysis→Analyze network),保存网络分析结果，然后用节点大小以及不同的颜色进行Degree的大小反映，节点越大生成的Degree值越大；其中Combine score(综合得分)的大小通过预设好的粗细边的值来进行反映，当其边越粗时，代表综合得分越大，在最后挑选出核心靶点，以此作出GsRb1治疗PD蛋白相互作用网络图。

1.2.3 GO富集分析与KEGG通路分析

通过将GsRb1与PD交集基因导入至DAVID数据库，标识的相关符号选择OFFICIAL_GENE_SYMBOL(基因),依旧选择与上述相同的物种设置：Homo Sapiens, 接下来选用DAVID6.8GO基因功能从生物过程层面(Biological Process, BP)、细胞成分层面(Cellular Component, CC)、分子功能层面(Molecular Function, MF)3个维度关注GsRb1治疗PD的作用靶蛋白的作用在基因功能的体现。为阐明GsRb1治疗PD的靶点在其信号通路中通过KEGG通路富集进行分析。选取二者(P<0.05)作为GsRb1治疗PD的主要基因功能富集过程以及信号通路，预测GsRb1治疗PD的作用机制。

1.2.4 分子对接

一般而言，在一个网络中Degree值越高，它的地位也就越重要。也就是说在蛋白相互作用网络中Degree值越靠前的蛋白在GsRb1治疗PD中发挥着重要作用。利用 AutoDock Vina(1.1.2)对GsRb1和之前预测的关键的作用靶点使用分子对接的方法，验证预测的作用靶点其相互作用活性。如下：(1)在PubChem的数据库里进行SDF格式的3D结构化合物的下载，并将其导入到Chembio 3D中，接下来进行能量最小化，然后导入AutodockTools-1.5.6加氢、计算电荷、分配电荷、通过将其设置为可旋转键，再将其保存为“pdbqt”格式；(2)从PDB(http: //www.rcsb.org/)数据库中将关键的靶蛋白进行下载(人源蛋白优先，原始配体与其对接的活性成分结构高度一致或者是相似的为最好，最后再选取分辨率高的);(3)将蛋白导入PyMoL(2.3.0)去除原始配体和水分子，接下来将蛋白导入AutoDocktools(v1.5.6)进行如上的相关操作；(4)对接盒子的中心的确定取决于蛋白原始配体，如果无原始配体则以其对接区域就使用报告的关键氨基酸残基的周围进行，并将格点盒子的大小设定为固定的格点：50×50×50(每个格点的间距为0.375Å),其余参数不变，均为默认；(5)最后利用PyMOL和Ligplot进行互相作用模式分析。

2、结果

2.1 GsRb1靶点预测结果

将Canonical SMILES导入SwissTargetPrediction, 以“probability>0”为筛选条件；将Canonical SMILES导入SEA,以“MaxTC”>0.23作为筛选条件；将Canonical SMILES导入SuperPred, 选取Known strong binders的靶点；将三个数据库的靶点合并，GsRb1有32个作用靶点。

2.2 PD相关靶点

通过GeneCards共获得9 717条PD的靶点，从OMIM数据库共获得202条PD的靶点，将以上两个使用的数据库中其共同靶点进行整理，合并同类项及去除重复值，共获得9 802个疾病相关靶点。

2.3 药物-疾病-靶点预测结果

将疾病靶点与药物靶点相互映射，共获得药物-疾病交集基因 21个；利用药物-疾病-靶点数据，构建“network.xlsx”文件以及“type.xlsx”文件，将文件导入Cytoscape 3.8.2进行作图，共有22个节点，21条边。见图1。

2.4 核心靶点及网络相互作用

将韦恩图得到的药物靶点与PD相关的共有靶点21个导入String(https: //string-db.org/)数据库中进行蛋白-蛋白相互作用预测，物种设置为：Homo Sapiens, 将网络文件保存为TSV格式，将TSV文件导入Cytoscape 3.8.2软件中绘制Ginsenoside Rb1与PD的蛋白相互作用网络，对网络进行拓扑分析，以degree值反映靶点大小及颜色，以combined score值反映边的粗细，进而明确构建起蛋白与蛋白彼此之间的互相密不可分的作用网络，该网络共有20个节点和46条边，根据网络拓扑分析，BCL2L1、VEGFA、FGF2、KDR为核心靶点。见图2。

图1 药物-疾病-靶点

图2 蛋白-蛋白相互作用网络图

2.5 生物功能富集分析

2.5.1 GO富集分析

取药物-疾病交集基因，用DAVID库进行相关的操作，共筛选出152条GO条目，其中BP相关的有92条，细胞成分(CC)38条，分子功能(MF)22条；分别选取以上生物过程的前10的条目绘制柱状图。生物过程(BP)含涉及负调控下的凋亡、相关基因表达的正调控、Notch受体加工、β淀粉样蛋白形成、淀粉样前体蛋白分解代谢过程、催化活性的正调节、蛋白加工、Notch信号通路、基因表达负调控、异常增殖的细胞所起到正调控；细胞成分主要涵盖了质膜、细胞质、核、胞液、还包括存在于细胞内广泛存在的内质网、核浆、内质网膜、线粒体等；其中分子功能主要涉及蛋白结合以及包括三磷酸腺苷结合、整合素结合、生长因子活性、碳水化合物结合、蛋白激酶活性、蛋白激酶结合、内肽酶激活剂活性、化学引诱活性。见图3。

图3 GO柱状图

2.5.2 KEGG通路富集分析

利用DAVID[12]数据库将其进行通路富集分析，共富集到28条与GsRb1治疗PD相关的通路，根据P<0.05筛选出与GsRb1治疗PD相关的通路，筛选出与PD相关的通路分别是：PI3K/Akt信号通路、钙信号通路、Notch信号通路、阿尔茨海默病、Ras信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、MAPK信号通路、寿命调节途径，AMPK信号通路、FoxO信号通路、胰岛素信号通路等。根据P值筛选排名前20条KEGG代谢通路，根据P值绘制气泡图。见图4。

图4 KEGG气泡图

2.6 分子对接验证

根据前文的分析可知选取重要靶点与GsRb1进行半柔性的分子对接，通过结合能表示小分子与靶蛋白彼此之间相互结合的亲疏程度，结合能达到0时则表示小分子与靶蛋白彼此之间存在自由结合，而值越小，则代表其互相结合的可能性也就越高。对接结果表明本实验预测的小分子均能顺利进入靶蛋白的活性中心。GsRb1与APH1A的Q83、S133、T164、S160分别形成一个氢键，长度分别为2.1A、2.9A、2.7A、2.9A;与APH1A的F132形成两个氢键，长度分别为3.0A、2.8A。GsRb1与BCL2L1的D107、Q111、W137分别形成一个氢键，氢键的长度分别为2.1A、2.1A、2.8A;与BCL2L1的R100形成两个氢键，氢键的长度分别为2.3A、2.4A;与BCL2L1的R132形成三个氢键，氢键的长度分别为2.3A、2.4A、2.5A。GsRb1与FGF2的G122、Q123分别形成一个氢键，长度分别为2.2A、2.8A;与FGF2的K119形成两个氢键，氢键的长度分别为2.4A、2.1A。GsRb1与KDR的R1066、R1027、D1046分别形成一个氢键，氢键的长度分别为2.3A、2.4A、2.3A。GsRb1与PSEN1的C140、D143、G144、G146、E644分别形成一个氢键，氢键的长度分别为2.2A、2.0A、2.1A、2.7A、2.0A。GsRb1与VEGFA的E38形成一个氢键，氢键的长度为2.0A;与VEGFA的R56形成两个氢键，氢键的长度分别为2.4A、2.1A。这些小分子与周围的氨基酸残基均形成了较强的疏水作用，见图5,表1。

3、讨论

近年来，通过网络药理学预测靶点并联合分子对接验证作用机制，成为临床研究中首选的研究方法，其可信度较高。候乔斌等[13]基于网络药理学及分子对接验证了青龙衣抗胃炎作用的潜在靶点和分子机制；朱成姗等[14]通过网络药理学和分子对接用睾丸间质细胞模型对恩施巴戟促进睾酮分泌的作用机制进行了探讨；而在李坤等[15]的最新研究中，通过网络药理学及分子对接成功探讨了慈丹胶囊治疗肝癌的作用机制。通过以上研究证实网络药理学+分子对接的结果的可信度。而在以往的研究中[16,17],GsRb1已被证实对于治疗脑部缺血类疾病中有一定的效果。在魏山山等[18]的研究中，证实了GsRb1对改善短时非空间学习记忆损伤具有一定的效果。在姚远等[19]的研究中进一步证实了GsRb1对小鼠坐骨神经损伤具有很好的修复作用。基于GsRb1的应用效果，本研究通过网络药理学及分子对接进行GsRb1对于治疗PD的预测及验证。通过使用SwissTargetPrediction、SEA、SuperPred三个数据库进行GsRb1靶点的筛选，选出重合的靶点共计32个；在 GeneCards和OMIM数据库中共筛选出PD相关靶点9 802个。将GsRb1与PD的靶点相互映射，然后作Veen图，从而获得交集基因；然后使用Cytoscape3.8.2软件构建“药物-作用靶点”网络，共有22个节点，21条边。将韦恩图得到的药物靶点与PD相关的共有靶点21个导入String(https: //string-db.org/)数据库中进行蛋白-蛋白相互作用预测，预测出核心靶点：BCL2L1、VEGFA、FGF2、KDR。将GsRb1治疗PD的核心靶点导入到DAVID数据库中，得到 GO 分析结果和 KEGG 富集结果。取药物-疾病交集基因，利用DAVID数据库将预测的相关结果进行GO基因功能富集的分析，共筛选出152条GO条目，其中生物过程相关的有92个条目，细胞成分所包括的条目38个，分子功能成分所包括的条目22个；此外，KEGG结果显示出GsRb1治疗PD所涉及的通路：PI3K/Akt信号通路、Notch信号通路、阿尔茨海默病、Ras信号通路、Ca+信号通路、MAPK、寿命调节途径-多物种、脂肪细胞因子信号通路等。通过对GsRb1的生物学过程进行解析可知，GsRb1主要涉及的通路中，细胞的凋亡过程中负调控、基因表达中的正调控、Notch受体加工、β淀粉样蛋白形成、淀粉样前体蛋白分解代谢过程、催化活性的正调节、蛋白加工、Notch信号通路、基因表达负调控等，表明上述GsRb1治疗PD主要与细胞的凋亡有关。此外，大量文献报道，PI3K/Akt作为参与PD的发病机制的重要通路之一，其介导的生物过程如：炎症反应、氧化应激反应等，都能够影响PD疾病的进程与进展，也就很好地为PD的防治提供了大方向的指导[20]。通过调控PI3K/Akt 信号通路可以有效减少PD模型的自噬[21]。通过使用BCL2L1、VEGFA、FGF2、KDR、APH1A核心靶点来进行分子对接，通过结合能来表示小分子与靶蛋白结合的紧密程度，其结合能的值越小结合的可能性就会相反地越高，预测的5个关键靶点结合能分别为-7.8、-7.6、-6.4、-8.7、-8.6。表明GsRb1可能通过预测靶点发挥治疗PD的作用。其中关键靶点主要与细胞的凋亡有关。因此，GsRb1作用于机体通过与PI3K/Akt信号通路，Ca2+信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路等多通路，尤其是将PI3K/Akt信号通路激活，从而抑制细胞的凋亡，达到发挥治疗PD的作用。在之前的研究中，网络药理学结果仅是一种单纯的非实验性研究，会存在一定不足。本文采用分子对接进行验证，通过验证关键靶点的结合能，证明预测的关键靶点能够很好地发挥作用。接下来会继续通过体内实验加以验证。

图5 小分子-蛋白相互作用模式图

表1 药物与核心靶蛋白对接结果

综上所述，GsRb1治疗PD通过PI3K/Akt信号通路、Notch信号通路、MAPK信号通路发挥其关键性作用，并可能通过减少细胞凋亡的生物过程发挥作用。本文利用目前广泛应用的现代生物信息学技术，研究了相关蛋白之间的相互关系网络，再对GsRb1治疗PD的可能作用机制进行探讨并加以验证。通过运用网络药理学研究也体现了中药活性成分治疗疾病的多靶点以及多个通路协同作用的特征。这为GsRb1治疗PD的分子机制提供了方向，也为中草药人参皂苷在临床上的应用提供了科学依据。

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基金资助:内蒙古自然科学基金(2021MS08128); 内蒙古自治区卫生健康科技计划项目(202201379);

文章来源:祝洪博,代玉晶,赵杰,等.基于网络药理学探讨人参皂苷Rb1治疗帕金森病的作用机制[J].包头医学院学报,2024,40(06):7-13.