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补肾活血方对复发性流产大鼠IL-17的影响

2024-07-09 70 上传者：管理员

摘要：目的观察补肾活血方对复发性流产(RSA)大鼠白细胞介素-17(IL-17)的治疗作用。方法用腹腔注射雌二醇苯甲酸酯的方法构建RSA模型大鼠。将40只RSA模型随机分为模型组、对照组和低、高剂量实验组，每组10只；另取10只健康孕鼠设为空白组。低、高剂量实验组分别灌胃含7.77、15.54 g·kg-1生药的补肾活血方溶液；对照组灌胃含2.10 mg·kg-1地屈孕酮的溶液；空白组和模型组均灌胃等量0.9%NaCl。5组大鼠的给药剂量均为10 mL·kg-1,每天1次，连续给药9 d。观察各组活胎数、胚胎丢失数、胚胎丢失率，用流式细胞仪检测外周血中Th17细胞构成比，用蛋白质印迹法检测蜕膜组织中IL-6、IL-17、IL-23蛋白的表达水平。结果高剂量实验组、对照组、模型组和空白组的活胎数分别为(11.50±2.84)、(11.50±3.10)、(6.30±1.25)和(12.50±3.24)个，胚胎丢失数分别为(1.80±0.42)、(1.90±0.57)、(4.90±1.37)和0个，胚胎丢失率分别为(14.01±4.52)%、(14.79±6.06)%、(43.50±9.49)%和0个，外周血Th17细胞构成比分别为(3.12±0.47)%、(3.10±0.59)%、(5.31±1.16)%和(2.54±0.71)%,IL-6蛋白相对表达水平分别为0.19±0.04、0.18±0.05、0.85±0.16和0.11±0.03,IL-17蛋白相对表达水平分别为0.28±0.04、0.29±0.05、0.84±0.12和0.09±0.01,IL-23蛋白相对表达水平分别为0.35±0.04、0.34±0.06、0.90±0.11和0.08±0.01。模型组的上述指标与高剂量实验组、对照组和空白组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论补肾活血方可减少RSA大鼠胚胎丢失、改善蜕膜组织病理变化，降低Th17细胞构成比和其相关细胞因子IL-6、IL-17、IL-23的表达。

关键词：
RSA
复发性流产
白细胞介素-17
胚胎丢失
补肾活血方
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复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指在妊娠28周之前发生≥3次自然流产，影响2%～5%的育龄妇女[1]。目前，临床针对RSA的治疗多采用激素替代、免疫治疗及抗凝治疗等方式，但效果不理想，且存在一定的药物不良反应[2]。补肾活血方是中医常用治疗方法之一，该方由中医经典补肾安胎方药寿胎丸《医学衷中参西录》及养血活血安胎方药芎归汤《景岳全书·妇人规》配伍而成，可滋补肾气、活化血行，改善子宫内环境，从而促进胚胎着床和生长[3]。白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)是Th17细胞的主要效应因子，可维持母胎免疫耐受和胎盘发育，当其表达异常时，可导致母胎免疫失调和胎盘功能障碍。研究发现，RSA患者外周血和蜕膜中IL-17表达水平均显著高于正常妊娠者，提示IL-17可能参与RSA的发生、发展[4]。本研究通过建立RSA大鼠模型，旨在探索补肾活血方对RSA大鼠IL-17的影响。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级SD大鼠，鼠龄8周，雄30只，雌60只，体质量(250±50)g, 购自上海昇敞生物科技有限公司。动物许可证号：SCXK(沪)2021-0002。本实验经江西省妇幼保健院实验动物伦理委员会批准(伦理批号：JXFYLS2022-0013)。

药品与试剂菟丝子，批号：220211,产地：内蒙古临河，当归，批号：220220,产地：甘肃，桑寄生，批号：210703,产地：辽宁，续断，批号：220217,产地：四川，玫瑰花，批号：210517,产地：山东，白术，批号：220214,产地：安徽亳州，均购自华润三九医药股份有限公司，均经江西省妇幼保健院夏晓健主任医师鉴定为正品；地屈孕酮片，规格：每片10 mg, 批号：20170111,注册证号：国药准字HJ20170221,荷兰Abbott Biologicals B.V.公司生产；雌二醇苯甲酸酯，规格：每桶1 kg, 纯度：99%,批号：20150916,湖北威德利化学科技有限公司生产；IL-6、IL-17、IL-23酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均由武汉酶免生物科技有限公司生产；兔抗大鼠IL-6、IL-17、IL-23一抗，均由美国Abcam公司生产。

仪器CytoFLEX流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司产品；Victor Nivo酶标仪，美国PE公司产品；min protean 3 cell电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；Tanon-5200凝胶成像系统，购自上海天能生命科学有限公司。

2 实验方法

2.1 药液制备

补肾活血方溶液配制取菟丝子15 g、当归15 g、桑寄生12 g、续断12 g、玫瑰花8 g、白术12 g, 用5倍水浸泡，过夜，先煮沸30 min, 倒出药液，再加入5倍水，煮沸20 min, 最后再加3倍水，煮沸20 min, 合并药液并旋蒸浓缩成含生药0.78、1.56 g·mL-1的补肾活血方溶液。

地屈孕酮溶液配制取地屈孕酮21 mg加入0.9%NaCl 100 mL中，摇匀，用过滤器过滤，使其质量浓度为0.21 mg·mL-1。

2.2 模型构建、动物分组与给药方法[5]5]

将雌雄大鼠按2∶1合笼配对，次晨观察到阴道涂片出现大量精子或发现雌鼠有阴道栓脱落为孕鼠妊娠的第1天，妊娠成功50只，随机选取10只纳入空白组，其余40只建立RSA模型，并随机分为模型组、对照组和低、高剂量实验组，每组10只。按照动物与人体间的等效剂量换算，大鼠给药量为7.77、15.54 g·kg-1(生药量),灌胃剂量均为10 mL·kg-1体质量。上午，模型组、对照组和低、高剂量实验组均腹腔注射0.5 mg·kg-1雌二醇苯甲酸酯建模，空白组腹腔注射等量0.9%NaCl。下午，进行药物干预，低、高剂量实验组分别灌胃含0.78、1.56 g·mL-1生药的补肾活血方溶液；对照组灌胃含2.10 mg·kg-1地屈孕酮的溶液；空白组和模型组均灌胃等量0.9%NaCl。5组大鼠的给药剂量均为10 mL·kg-1,每天1次，连续给药9 d。

2.3 活胎数和胚胎丢失情况[6]6]

解剖分离出各组大鼠子宫，观察活胎数、胚胎丢失数，并计算胚胎丢失率。胚胎丢失率=胚胎丢失数/总胚胎数×100%。

2.4 组织取材

用小号组织钳于子宫角处钝性分离子宫壁，从着床位置将胚胎与胎盘剥离下来，移至灭菌培养皿中，分离着床位置蜕膜组织，每只大鼠取5个着床位置，用预冷磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)冲洗，无菌纸过滤、吸附，转移至灭菌冻存管中，液氮中保存。将蜕膜组织分成2份，一份用于检测蛋白表达水平，另一份用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察。

2.5 流式细胞仪检测外周血Th17细胞构成比[7]7]

取腹主动脉血0.5 mL,EDTA抗凝，分装到离心管中，洗涤，添加CD4标记的抗体混合物10 μL;用穿孔剂增加细胞膜通透性，固定化剂固定；用荧光标记的抗体来检测Th17的转录因子维A酸相关孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt, RORγt)。用流式细胞仪分析外周血Th17细胞构成比。

2.6 蛋白质印迹法检测蜕膜组织中IL-6、IL-17、IL-23蛋白的表达水平[8]8]

取液氮保存的蜕膜组织，PBS洗涤，用研磨器研磨后裂解，离心收集上清液，用BCA试剂盒定量，用上样缓冲液混合并加热，凝胶电泳分离蛋白质，每孔加蛋白质40 μg, 转膜，加入含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭1 h, 加入稀释后的兔抗人IL-6、IL-17、IL-23单克隆抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，用稀释后的羊抗兔免疫球蛋白G二抗孵育1 h, ECL发光底物检测信号，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参，用Image J软件分析IL-6、IL-17、IL-23条带灰度值，计算目的蛋白相对表达水平。

2.7 HE染色观察蜕膜组织病理改变[9]9]

取液氮保存的蜕膜组织，10%中性甲醛溶液固定24 h, 脱水、透明、包埋，制成4 μm厚度石蜡切片，60 ℃烘箱中烘干，二甲苯脱蜡，梯度浓度乙醇脱水，放入苏木精染液中染色5～10 min, 清水冲洗后用稀盐酸乙醇溶液分化，继续冲洗后加入碳酸氢钠溶液返蓝，放入伊红染液中染色3 min, 常规冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明处理，中性树胶封片，烘箱烘干，用显微镜观察病理改变。

3 统计学处理

用SPSS 24.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。

二、结果

1 5组大鼠活胎数、胚胎丢失情况的比较

低、高剂量实验组给予含0.78、1.56 g·mL-1生药的补肾活血方溶液；对照组给予含2.10 mg·kg-1地屈孕酮的溶液；空白组和模型组均给予等量0.9%NaCl。

模型组的活胎数、胚胎丢失数、胚胎丢失率与空白组比较，低、高剂量实验组和对照组的上述指标与模型组比较，高剂量实验组和对照组的上述指标与低剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表1。

表1 5组大鼠活胎数、胚胎丢失情况的比较

2 5组大鼠外周血Th17细胞构成比的比较

低、高剂量实验组和对照组、模型组、空白组外周血中Th17细胞构成比分别为(4.20±0.54)%、(3.12±0.47)%、(3.10±0.59)%、(5.31±1.16)%和(2.54±0.71)%。模型组的Th17细胞构成比与空白组比较，低、高剂量实验组和对照组的Th17细胞构成比与模型组比较，高剂量实验组、对照组的Th17细胞构成比与低剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

3 5组大鼠蜕膜组织中IL-6、IL-17、IL-23蛋白表达水平的比较

低、高剂量实验组和对照组、模型组、空白组蜕膜组织中IL-6蛋白相对表达水平分别为0.75±0.13、0.19±0.04、0.18±0.05、0.85±0.16和0.11±0.03,IL-17蛋白相对表达水平分别为0.71±0.09、0.28±0.04、0.29±0.05、0.84±0.12和0.09±0.01,IL-23蛋白相对表达水平分别为0.81±0.09、0.35±0.04、0.34±0.06、0.90±0.11和0.08±0.01。模型组蜕膜组织中IL-6、IL-17、IL-23蛋白相对表达水平与空白组比较，低、高剂量实验组和对照组的上述指标与模型组比较，高剂量实验组、对照组的上述指标与低剂量实验组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见图1。

4 5组大鼠蜕膜组织的病理变化

HE染色结果显示：空白组子宫蜕膜组织完整，腺体排列分布及间质比例规则，未见水肿样及腺样分化改变；模型组子宫蜕膜组织结构破坏严重，腺体排列不规则，细胞核固缩，胞浆水肿或空泡，可见大量炎症细胞，肌层轻微异性化改变；低剂量实验组子宫蜕膜组织部分完整，腺体排列松散，间质比例基本正常，可见部分立方形异常细胞浸润至肌层浅表，上皮组织部分缺失；高剂量实验组和对照组子宫蜕膜组织结构基本完整，腺体排列整齐，细胞核清晰，胞浆丰富，可见少量异常炎症细胞，未见水肿样及腺样分化改变，肌层基本正常。结果见图2。

图1 以蛋白质印迹法检测5组大鼠蜕膜组织中白细胞介素(IL)-6、IL-17、IL-23蛋白的表达情况

图2 5组大鼠蜕膜组织的病理变化情况(苏木精-伊红染色，×400)

三、讨论

RSA的发病机制较为复杂，包括遗传、解剖、免疫、内分泌、感染及凝血等多种因素，其中免疫因素被认为是最重要的因素之一，可能涉及胎盘组织内多种分子及细胞水平的调节失衡[10]。Th17细胞是调节胎盘组织免疫耐受及炎症反应的重要T细胞亚群。当Th17过度激活时，会分泌大量促炎因子，引起子宫内膜和胎盘炎症反应，导致子宫内膜及胎盘组织损伤、凋亡、坏死，从而影响胚胎着床和滋养层侵袭，干扰母体和胎儿之间的物质交换和免疫耐受，使免疫耐受机制紊乱，最终导致胚胎融合异常并流产[11]。中医将RSA归属于“暗产”“数堕胎”“滑胎”等范畴，乃肾虚血瘀所致，治疗应以补肾固本、活血化瘀为主。本研究中补肾活血方组方具有补肾、活血、固胎之效，全方既补先、后之天，以滋两脏之精气，又理气祛瘀以安胎，使养胎有源，固胎有力。赵佳琳等[12]研究表明，补肾活血方可改善肾虚血瘀型RSA小鼠子宫免疫微环境，促进胚胎植入。赵小萱等[13]研究发现，补肾活血方对RSA蜕膜基质细胞功能具有调节作用，提示该方可用于治疗RSA。本研究结果显示，补肾活血方可减少RSA大鼠胚胎丢失。

IL-6、IL-17、IL-23在妊娠过程中可抑制绒毛膜促性腺激素的表达，降低滋养层细胞对转化生长因子β反应性，从而降低滋养层细胞的侵袭能力。现代药理学表明，菟丝子中的有效成分具有免疫调节作用，可影响免疫细胞的活性和细胞因子的产生，从而改善免疫平衡并降低自身免疫反应，减轻子宫内膜损伤，维持子宫内环境的稳定，提高胚胎着床和发育成功率；桑寄生提取物中的活性成分具有一定的血管活性作用，包括扩张血管和改善血液循环，可增加子宫内膜和胚胎供血，改善子宫内环境，有助于促进胚胎着床和发育，减少流产[14,15]。

本研究结果显示，与模型组比较，低、高剂量实验组外周血中Th17细胞构成比，以及血清和蜕膜组织中IL-6、IL-17、IL-23表达均显著降低，提示补肾活血方可降低Th17细胞构成比和其相关细胞因子表达。

参考文献:

[3]韩永梅,卫爱武.补肾活血方对肾虚血瘀型复发性流产小鼠胚胎植入及子宫免疫微环境的影响[J].中成药,2022,44(3):937—942.

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[9]李时超,王杰,陈超,等.华蟾素对FOLFOX化疗小鼠肠道炎症及黏膜屏障的影响[J].中国临床药理学杂志,2022,38(1):35—39.

[10]杨冬梅,雷磊.寿胎丸干预复发性流产大鼠模型的尿液代谢组学研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(1):81—85.

[12]赵佳琳,陈萍,徐广立,等.补肾活血方通过下调JAK2/STAT3通路改善小鼠的复发性流产[J].南方医科大学学报,2023,43(2):265—270.

[13]赵小萱,冯晓玲,周旋,等.补肾活血方及有效组分对抗心磷脂抗体阳性复发性流产蜕膜基质细胞TLR4/NF-κB/COX-2通路的影响[J].中华中医药杂志,2021,36(8):4658—4663.

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[15]郑紫云,柴书彤,陈婕,等.北桑寄生产黄酮内生菌的分离鉴定及其抗氧化和抑菌活性评价[J].微生物学通报,2022,49(9):3798—3812.

基金资助:国家中医药管理局第七批全国名老中医药专家学术经验继承工作资助项目(国中医药人教函[2022]76号); 廖彩森全国名老中医药专家传承工作室(国中医药人教函[2022]75号); 江西省卫生健康委科技计划基金资助项目(SKJP220218590); 中国妇幼保健协会-华润三九中医中西医结合妇幼健康专项研究基金资助项目(ZXY2020B06);

文章来源:彭瑶,陈瑾,梁艳,等.补肾活血方对复发性流产大鼠IL-17的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1928-1932.