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脉血康胶囊减轻IgA肾病大鼠肾纤维化的作用和机制

2024-07-09 118 上传者：管理员

摘要：目的探讨脉血康胶囊对免疫球蛋白A肾病(IgAN)大鼠肾纤维化的改善及对Janus酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活因子家族3(STAT3)信号通路的抑制作用。方法用600 mg·kg-1改良的牛血清白蛋白(BSA)+脂多糖0.2 mL(LPS)+四氯化碳(CCl4)0.1 mL方案建立IgAN大鼠模型。将55只SD大鼠随机分为空白对照组(蒸馏水+0.9%NaCl)、模型组(IgAN模型)、阳性对照组(建模后灌胃给予替米沙坦片10 mg·kg-1)和低、中、高3个剂量实验组(建模后灌胃给予脉血康胶囊16、44和84 ATU·kg-1)。检测大鼠24 h尿蛋白；用全自动生化分析仪测定血肌酸酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)水平；用苏木精-伊红(HE)染色法观察肾组织形态；用免疫荧光法检测IgA在大鼠肾中的沉积；用蛋白质印迹法检测肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、JAK2、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达。结果空白对照组、模型组、阳性对照组与高剂量实验组的血Scr分别为(41.42±2.30)、(59.82±5.36)、(50.28±3.18)和(50.47±7.19)μmol·L-1,24 h尿蛋白分别为(2.35±1.21)、(11.62±3.45)、(5.01±4.36)和(8.14±4.19)mg·d-1,α-SMA蛋白相对表达水平分别为0.48±0.10、1.00±0.00、0.71±0.13和0.57±0.22,TGF-β1蛋白相对表达水平分别为0.54±0.93、1.00±0.00、0.73±0.33和0.51±0.31,JAK2蛋白相对表达水平分别为0.36±0.22、1.00±0.00、0.82±0.36和0.57±0.28,p-STAT3/STAT3分别为0.40±0.19、1.00±0.00、0.46±0.18和0.31±0.18。模型组的上述指标与空白对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),阳性对照组和高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论脉血康胶囊可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活减轻IgAN大鼠肾纤维化水平，保护肾功能。

关键词：
IgAN
Janus酪氨酸蛋白激酶2/信号转导与转录激活因子家族3
免疫球蛋白A肾病
纤维化
脉血康胶囊
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免疫球蛋白A肾病(immunoglobulin A nephropathy, IgAN)是世界范围内最常见的原发性肾小球肾炎，30%的患者经肾活检确诊后20～30年内可进展为终末期肾病，是导致病人终末期肾病最主要的病因[1]。IgAN的特征是以IgA为基础的免疫复合物在肾系膜区沉积，引起系膜细胞增生、肾小球节段性硬化及肾间质纤维化[2]。脉血康胶囊以吸血水蛭为主要成分，临床研究表明脉血康胶囊可以降低慢性肾病患者血肌酸酐、血尿素氮和尿蛋白，延缓肾病进展[3]。本研究旨在探讨脉血康胶囊治疗IgAN大鼠的具体机制，为其在临床应用提供更可靠的依据。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级别6～8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠55只，体质量(180±20) g, 购自新疆医科大学动物实验中心。动物许可证号：SYXK(新)2018-0003。本研究经新疆医科大学动物实验中心伦理委员会批准(伦理批号：IACUC-20230627-19)。

药品与试剂脉血康胶囊，规格：每粒0.25 g, 每粒胶囊相当于14个ATU(抗凝血酶活性单位),批号：20221021,批准文号：国药准字Z20033197,贵州信邦制药股份有限公司生产；替米沙坦片，规格：每片80 mg, 批号：F78488,注册文号：国药准字J20090089,勃林格殷格翰药业有限公司生产。牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),均购自美国Sigma公司；蓖麻油、四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4),均购自上海麦克林生化科技公司；尿蛋白试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；血肌酸酐(serum creatinine, Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, GOT)试剂盒，均购自迈瑞公司；抗α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth-muscle-actin, α-SMA)、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)蛋白抗体、FITC 标记山羊抗大鼠 IgA 抗体，购自美国Abcam公司；抗转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)、抗Janus酪氨酸蛋白激酶2(Janus kinase, JAK2)、抗信号转导与转录激活因子家族 3(signal transducers and activators of tra-nscription-3,STAT3)、抗磷酸化STAT3(phosphorylated STAT 3,p-STAT3)抗体，均购自北京博奥森生物技术有限公司。

仪器BS-350全自动生化分析仪，迈瑞公司产品；043BR26378电泳仪、Chemidoc MP全自动成像系统，均为美国BIO-RAD公司产品；CM1950冰冻切片机、TCS SP8激光共聚焦显微镜，均为德国Leica公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建

参照文献[4]中改良方案构建 IgAN大鼠模型：600 mg·kg-1 BSA隔天灌胃，连续12周；皮下联合注射蓖麻油0.3 mL和CCl4 0.1 mL,每周1次，连续12周；于第6、8周末尾静脉注射LPS 0.2 mL;空白对照组大鼠予以等量蒸馏水灌胃，等量0.9%NaCl皮下注射和尾静脉注射，其频率同造模组，造模过程大鼠无死亡。

2.2 动物分组及给药方法

将55只SD雄性大鼠适应性喂养1周后，随机分配10只进入空白对照组、45只进行造模。造模成功后将剩余40只模型组大鼠随机分配到模型组、阳性对照组和低、中、高剂量实验组，每组各8只。按照实验动物与人用药量的换算，阳性对照组大鼠每日给予替米沙坦片混悬液灌胃10 mg·kg-1,低、中、高剂量实验组大鼠每日按照16、44和84 ATU·kg-1的剂量给予脉血康胶囊混悬液灌胃，模型组大鼠给予等量蒸馏水灌胃，连续干预28 d。

2.3 样品收集

所有大鼠实验结束前置于代谢笼中收集24 h尿液，随后禁食不禁水24 h, 10% 水合氯醛腹腔注射，大鼠麻醉后，腹主动脉采血，离心，收集血液上清液置于-80 ℃冰箱保存待测；取肾组织，部分于4%多聚甲醛中固定，制石蜡切片和冰冻切片；剩余组织置于-80 ℃冰箱待用。

2.4 24 h尿蛋白与血清Scr、BUN、GPT、GOT的检测[5]5]

用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清生化指标，包括血清Scr、BUN、GPT、GOT水平；按尿蛋白试剂盒说明书方法加样，用酶标仪在595 nm波长测定光密度值。

2.5 苏木精-伊红 (hemotoxylin-eosin, HE)染色法观察肾组织病理学改变[6]6]

取新鲜肾组织置于4%多聚甲醛中固定24 h, 随后脱水、包埋，用切片机切成2 μm厚度，制作石蜡切片。将制作好的石蜡切片置于烤箱1 h, 取出转移至脱蜡液、梯度乙醇中脱蜡、水化，随后放于苏木精-伊红中染色，中性树胶封片，完成后将HE染色切片置于光学显微镜下观察并拍照。

2.6 免疫荧光法观察肾组织IgA的沉积[7]7]

取新鲜肾组织置于4%多聚甲醛中固定4 h, 随后转移至30%蔗糖脱水过夜，次日用OCT胶包埋，用冰冻切片机切片，制作冰冻切片。取出制作好的冰冻切片，4%多聚甲醛固定，5% BSA封闭，FITC标记山羊抗大鼠 IgA 抗体孵育过夜，次日4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色，封片，置于激光共聚焦荧光显微镜下观察并拍照。

2.7 蛋白质印迹法检测肾组织蛋白的表达水平[8]8]

取组织充分研磨后提取总蛋白，蛋白定量后100 ℃变性10 min, 将等量蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转至聚偏二氟乙烯膜，5%BSA封闭2 h, 加入一抗，4 ℃孵育过夜，次日加入相应同种属的二抗，室温2 h孵育，随后用蛋白凝胶成像仪拍照和定量分析。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料均用

表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。

二、结果

1 免疫荧光显示IgAN大鼠模型建立成功

SD大鼠随机分为空白对照组(蒸馏水+0.9% NaCl)、模型组(IgAN模型)、阳性对照组(建模后灌胃给予替米沙坦片10 mg·kg-1)和低、中、高3个剂量实验组(建模后灌胃给予脉血康胶囊16、44和84 ATU·kg-1)。

免疫荧光显示，空白对照组、模型组的IgA免疫球蛋白的累计光密度值分别为10 513.06±412.94和20 116.06±323.52,与空白对照组比较，模型组大鼠IgA免疫球蛋白在肾小球区域的的沉积显著增多(P<0.05),提示IgA肾病大鼠模型建立成功，见图1。

图1 大鼠肾组织免疫球蛋白A(IgA)沉积(×40)

2 各组大鼠24 h尿蛋白及肝肾功能的比较

与空白对照组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白含量、血清Scr含量均显著增高(均P<0.05),BUN含量无显著改变(P>0.05)。与模型组比较，给药后，低、中、高剂量实验组与阳性对照组的Scr值均显著降低(均P<0.05);同时，阳性对照组与中剂量实验组的24 h尿蛋白值均也显著降低(均P<0.05)。此外，与空白对照组比较，模型组大鼠GOT、GPT含量均无显著变化(均P>0.05);与模型组比较，给药后，各给药组大鼠的血清GOT、GPT含量均无显著变化(均P>0.05),提示脉血康胶囊对肝功能无显著损伤，见表1。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白(24-UTP)及肝肾功能的比较

3 各组大鼠肾组织形态学的比较

空白对照组肾小球结构正常，肾间质未见炎症损伤；与空白对照组大鼠比较，模型组大鼠肾小球可见不同程度的系膜增生，基底膜增厚，血管袢紊乱，肾间质可见轻度水肿，炎症细胞浸润；与模型组大鼠比较，阳性对照组与低、中、高剂量实验组的系膜增生与炎症细胞浸润程度均减轻，见图2。

图2 各组大鼠肾组织的病理变化情况(×40)

4 各组大鼠肾组织中α-SMA、TGF-β1蛋白的表达的比较

空白对照组、模型组、阳性对照组与低、中、高剂量实验组的α-SMA蛋白相对表达水平分别为0.48±0.10、1.00±0.00、0.71±0.13、0.57±0.19、0.65±0.12和0.57±0.22,TGF-β1蛋白相对表达水平分别为0.54±0.93、1.00±0.00、0.73±0.33、0.55±0.26、0.60±0.27和0.51±0.31。与空白对照组比较，模型组大鼠肾组织中α-SMA、TGF-β1蛋白的表达均显著上调(均P<0.05);与模型组比较，阳性对照组和低、中、高剂量实验组的大鼠肾组织中α-SMA蛋白的表达均显著下调(均P<0.05),TGF-β1蛋白在低剂量和高剂量实验组的表达均显著下调(均P<0.05);阳性对照组α-SMA、TGF-β1蛋白的表达和低、中、高剂量实验组比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),提示脉血康胶囊可下调TGF-β1和α-SMA蛋白的表达，延缓肾纤维化进展。

5 各组大鼠肾组织中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达的比较

空白对照组、模型组、阳性对照组与低、中、高剂量实验组的JAK2蛋白相对表达水平分别为0.36±0.22、1.00±0、0.82±0.36、0.83±0.16、0.46±0.26、0.57±0.28,p-STAT3/STAT3分别为0.40±0.19、1.00±0、0.46±0.18、0.61±0.36、0.82±0.35、0.31±0.18。与空白对照组比较，模型组大鼠肾组织中JAK2、p-STAT3/STAT3均显著升高(均P<0.05);与模型组比较，中、高剂量实验组的大鼠肾组织中JAK2表达均显著降低(均P<0.05),阳性对照组、高剂量实验组的p-STAT3/STAT3均显著降低(均P<0.05);阳性对照组和低、中、高剂量实验组之间的JAK2、p-STAT3/STAT3比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),提示脉血康胶囊可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化，降低大鼠肾纤维化水平。

三、讨论

中医疗法在IgAN的治疗中一直占据着很大的地位，已有了雷公藤、黄葵、黄芪、大黄酚等多种中药用于治疗IgAN的相关研究[9]。脉血康胶囊在临床治疗IgAN中已经应用多年，其主要成分为水蛭，水蛭的主要活性成分为水蛭素；研究表明，天然水蛭素具有抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗纤维化、减轻脑损伤以及改善肾功能等作用[10]。在IgAN的进程中，持续的炎症反应推动肾间质纤维化的发生，最终导致肾功能丧失，走向终末期肾病。因此，抗炎抗纤维化是防治IgAN走向终末期肾病的重要靶点。TGF-β1是已知作用最强的促纤维化细胞因子，α-SMA是平滑肌细胞和肌成纤维细胞的标志蛋白[11,12]。本研究结果表明，脉血康胶囊可以降低IgAN大鼠肾α-SMA、TGF-β1蛋白的表达，有效延缓肾疾病纤维化进展。

JAK2/STAT3是一条由多种细胞因子刺激的信号通路，广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等多种重要的生物学过程。研究显示，IgAN患者肾病理切片中JAK2、p-STAT1在肾小球系膜和内皮细胞中染色增强，JAK2、p-STAT1和p-STAT3蛋白在肾小管间质的染色增强[13]。LIU等[14]研究发现，美洲大蠊提取物可以通过抑制JAK2/STAT3信号通路的活化减轻肾纤维化。STAT3蛋白在非增生性肾小球肾炎中的表达正常，但在IgAN等增生性肾小球肾炎中的表达显著增加[15]。在TGF-β处理的NRK-49F细胞中也观察到STAT3蛋白磷酸化水平的增加[16],说明STAT3的过度激活可导致肾间质纤维化。本研究结果显示，脉血康胶囊能够抑制IgAN大鼠肾JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达，提示脉血康胶囊可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化，进而发挥抗纤维化的功效。

参考文献:

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[12]孟晓明,蓝辉耀.转化生长因子-β与肾纤维化的研究进展[J].生理学报,2018,70(6):612—622.

基金资助:科技创新领军人才基金资助项目(2022TSYCLJ0022);

文章来源:陆瑾瑜,丁爱霞,陆晨.脉血康胶囊减轻IgA肾病大鼠肾纤维化的作用和机制[J].中国临床药理学杂志,2024,40(13):1908-1912.